[发明专利]杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用。 

背景技术

赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。其中赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大，在霉变谷物、饲料等中最常见。OTA主要经胃肠道吸收，在人体血液中半衰期长达840h，有很强的肝毒性和肾毒性，是引起巴尔干肾炎的主要原因，除此，其还具有致畸和致癌作用，与上尿路肿瘤发生率的增加密切相关。鉴于OTA的肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性和致畸性，其被世界卫生组织定为2B类可疑人类致癌物。且OTA有很高的化学稳定性和热稳定性，因此OTA污染问题引起了世界各国的广泛关注。为此，很多组织都对食品及饲料中的OTA含量进行了严格限定，如欧盟规定谷类等食品中OTA最高浓度为5μg/kg，国际粮农组织/世界卫生组织联合食品添加剂委员会暂定人每日对OTA最大耐受量为0.17ng/(kg·d)。而我国又属于小农户分散型的种植模式，因此鉴于OTA的广泛发生性，加强对食品及农产品中OTA的检测尤其是快速检测，对保障我国食品安全消费具有重要意义。 

现有的对赭曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法对赭曲霉毒素A进行检测时，不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包括高效液相色谱法和液相色谱与质谱联用方法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求赭曲霉毒素A样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年 发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，其中，抗体作为免疫反应的核心试剂，为了建立针对抗赭曲霉毒素A的免疫学检测技术，必须先制得灵敏度高、特异性好的抗赭曲霉毒素A的抗体。发明内容 

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用。 

本发明提供了杂交瘤细胞株1H2，该杂交瘤细胞株已于2013年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201329。其具有序列表中SEQ ID No.1所示的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID No.2所示的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。 

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。该抗赭曲霉毒素A单克隆抗体可以识别赭曲霉毒素A，对赭曲霉毒素A的50％抑制浓度IC₅₀为52pg/mL。 

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体在赭曲霉毒素A含量测定中的应用。 

本发明提供的杂交瘤细胞株1H2是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗赭曲霉毒素A 而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用赭曲霉毒素A作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株1H2。 

本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株1H2注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗赭曲霉毒素A单克隆抗体。