[发明专利]一种制备树突状细胞的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种制备树突状细胞的方法，其特征在于，包括如下工序：在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、白介素-4IL-4、佛波醇乙酯PMA和脂多糖LPS条件下，体外培养获得高表达共刺激分子4-1BBL、CD80、CD83和CD86的树突状细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该体外培养方法分两步：第一步，单个核细胞诱导成未成熟树突细胞，

单个核细胞放在基础培养基中，该基础培养基含500IU-5000IU/mLGM-CSF、100IU-2000IU/mL IL-4、1ng-100ng/mL PMA、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠，以及体积比5％自体血清；然后于37℃，5％CO₂培养箱中培养获得未成熟树突状细胞；

第二步，未成熟树突状细胞诱导获得成熟树突状细胞，

将第一步中未成熟树突状细胞放在基础培养基中，该基础培养基含500IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU-2000IU/mL IL-4、1ng-100ng/mL PMA、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠，以及体积比5％自体血清；然后负载相关抗原后，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，一天后添加1ng/mL-200ng/mL LPS继续培养，进而获得成熟树突状细胞。

3.一种制备树突状细胞的方法，其特征在于，

第一步：单个核细胞诱导成未成熟树突细胞的体外培养

单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有5％的自体血清、2000IU/mLGM-CSF、1500IU/mLIL-4、100ng/mL PMA、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠；于37℃、5％CO₂培养箱中培养；在培养到第三天时细胞更换新鲜培养基，该新鲜培养基含2000IU/mL GM-CSF、1500IU/mL IL-4和100ng/mL PMA；培养到第五天收获未成熟树突状细胞；

将所述的未成熟树突状细胞进行细胞活率和细胞表型检测，以确定其为未成熟树突状细胞；

所述细胞活率检测方法为：计算培养最后一天的活细胞数；取1mL最后一天培养的培养液，1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液用1×PBS稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98％以上；

所述细胞表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的3×10⁶细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD80单抗、20μL PE标记鼠抗人CD86单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD11c单抗；第二组分别添加20μL FITC标记鼠抗人4-1BBL单抗、20μL PE标记鼠抗人CD83单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD11c单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测；

第二步：未成熟树突状细胞诱导获得成熟树突状细胞的体外培养

取上述未成熟树突状细胞，用培养基诱导培养重悬，该培养基含有5％的自体血清、2000IU/mLGM-CSF、1500IU/mL IL-4、100ng/mL PMA、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠；在第5天时添加抗原，负载于树突状细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜；第6天添加树突状细胞成熟因子50ng/mL LPS，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养；第7天通过1000rpm离心10min，收获成熟树突状细胞；

将所述的成熟树突状细胞，进行细胞活率和细胞表型检测，以确定其为成熟树突状细胞；

其中，细胞活率检测方法为：计算培养最后一天的活细胞数；取1mL最后一天培养的培养液，在1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液用1×PBS稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98％以上；

细胞表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的3×10⁶细胞，分三组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD80单抗、20μL PE标记鼠抗人CD86单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD11c单抗；第二组分别添加20μL FITC标记鼠抗人4-1BBL单抗、20μL PE标记鼠抗人CD83单抗和20μL PerCP标记鼠抗人CD11c单抗；第三组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgG1、20μL PE标记鼠IgG1和20μL PerCP标记鼠IgG1；置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。