[发明专利]一种制备树突状细胞的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及树突状细胞的制备方法，试剂盒制备等。本发明涉及的促进人外周血、骨髓和脐血中单个核细胞诱导增殖为树突状细胞，高表达共刺激分子，具有激活机体效应性T淋巴细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的免疫治疗。

背景技术

目前，癌症的细胞免疫治疗给患者提供继三大常规治疗的“第四种模式”，没有放化疗带来的巨大毒副作用，达到了相对安全，提高了患者生活品质，有尊严的治疗方式。树突状细胞在该细胞免疫治疗中起着主要作用，并在临床治疗中应用。

4-1BB配体/4-1BB信号转导途径是除B7/CD28(B7分为CD80和CD86)之外的共刺激信号，作为共刺激途径，它既能提供共刺激信号激活T细胞，使T细胞活化、增殖和分泌细胞因子，同时它介导的反向共刺激信号诱导抗原呈递细胞活化、增殖分泌细胞因子，是激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的关键分子。4-1BB配体(4-1BBL)可不依赖B7/CD28信号途径增强抗肿瘤免疫反应。

4-1BBL/4-1BB在树突状细胞中共表达。高表达4-1BBL的树突状细胞能提高T细胞增殖能力及机体免疫力，并增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。日前现有技术中已有通过腺病毒重组4-1BBL基因转染树突状细胞，以提高其在树突状细胞中的表达。但是转基因技术目前还无法应用到临床中，存在着重大的伦理学问题。

针对以提高4-1BBL在树突状细胞中的表达，而发挥更好的抗肿瘤免疫应答，本发明采用了从植物提取的天然化合物-佛波醇乙酯(其已在临床中应用)，进行诱导树突状细胞表达4-1BBL以及其他共刺激分子的表达，从而促进树突状细胞具有更强的抗肿瘤免疫应答作用。

发明内容

树突状细胞体外诱导和成熟过程中，现有技术主要促使其表达常见的共刺激分子B7-1/B7-2(CD80/CD86)，低表达4-1BBL共刺激分子。4-1BBL是不依赖B7/CD28信号途径，激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的关键分子。4-1BBL在树突状细胞中的表达成为关键指标。本发明应用天然药物分子-佛波醇乙酯，体外培养树突状细胞过程促使其高表达4-1BBL和常见共刺激分子(CD80、CD86和CD83等)，激发树突状细胞更强的抗肿瘤免疫应答作用。

本发明涉及树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括如下工序：在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、佛波醇乙酯(PMA)和脂多糖(LPS)条件下，培养获得高表达共刺激分子4-1BBL、CD80、CD83和CD86的树突状细胞。

本发明所采用的培养瓶优选25cm²或75cm²培养瓶，或选用塑料培养皿。

优选地，本发明所述方法分两步：第一步，单个核细胞诱导成未成熟树突细胞。单个核细胞在基础培养基中(含500IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU-2000IU/mL IL-4、1ng-100ng/mL PMA、1×非必需氨基酸1×丙酮酸钠，以及体积比5％自体血清)，37℃，5％CO₂培养箱中培养获得未成熟树突状细胞。其高表达共刺激分子4-1BBL、CD80和CD86。其中，CD80+/CD11c+细胞为89％以上，CD86+/CD11c细胞为91％以上，4-1BBL/CD11c+细胞为62％以上，CD83+/CD11c+细胞为40％以上。

第二步，未成熟树突状细胞诱导获得成熟树突状细胞。将第一步中未成熟树突状细胞在基础培养基中(含500IU-5000IU/mL GM-CSF、100IU-2000IU/mL IL-4、1ng-100ng/mL PMA、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠，以及体积比5％自体血清)负载相关抗原后，37℃，5％CO₂培养箱中培养，一天后添加1ng/mL-200ng/mL LPS继续培养。进而获得成熟树突状细胞。其高表达共刺激分子4-1BBL、CD80、CD83和CD86。其中，CD80+/CD11c+细胞为95％以上，CD86+/CD11c细胞为95％以上，4-1BBL/CD11c+细胞为85％以上，CD83+/CD11c+细胞为95％以上(高表达)。

更优选地，第一步：单个核细胞诱导成未成熟树突细胞的体外培养。