[发明专利]水稻或水稻加工品中Bt基因快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农产品检验领域，涉及水稻或水稻加工品中Bt基因快速检测方法。

背景技术

随着全球人口急速迈向70亿关口，转基因作物的种植面积在连续猛增15年之后继续攀升。据国际农业生物技术应用服务中心(the International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)统计，2011年全球转基因农作物种植面积达到1.6亿公顷。2011年，种植转基因作物的国家有29个，其中，主要种植国家为美国、巴西、阿根廷、印度、加拿大和中国。我国转基因作物的种植面积居世界第6位，在2011年达到了390万公顷^[1]。2009年11月，我国农业部批准了华恢1号和Bt63抗虫水稻在湖南省种植的安全证书，这说明转基因水稻在我国的商业化种植指日可待。

转基因作物对人体健康及生态环境的潜在风险一直以来备受关注^[2-3]。由于转基因食品缺乏长期的安全性试验数据，因而长期的食用安全无法确定，欧盟、美国、日本及我国等许多国家都相继制定了转基因生物的管理法规，对转基因食品采取标签管理和溯源管理制度。2012年，中国出口到欧盟的米制品，由于被检出含有转基因成分，频频遭到审查、通报、撤架。因此，为保护我国的贸易出口，迫切需要建立一种准确、特异、快速的转基因作物检测方法。传统的核酸检测操作步骤繁琐，检测时间较长因此不适合于现场实时检测和跟踪检测；并且需要PCR扩增仪等昂贵的设备，检测成本高，对检验人员的知识、操作水平要求高，不能满足现行的核酸检测现场监管需要。

与原料的转基因检测相比，加工品经过若干道加工程序，原料DNA在加工过程中不可避免的遭到一定程度的降解，加工过程中出现的某些物理、化学或酶因子也会影响DNA的质量，并且会对核酸的扩增产生抑制效应，这些因素都增加了加工品中转基因成分检测的难度。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种水稻或水稻加工品中Bt基因快速检测方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻或水稻加工品中Bt基因快速检测方法,包含如下步骤：

（1）提取水稻或水稻加工品基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以上游外引物F3:SEQ ID NO.1、下游外引物B3：SEQ ID NO.2、上游内引物FIP：SEQ ID NO.3、下游内引物BIP：SEQ ID NO.4进行LAMP扩增；

（3）扩增产物用两种方法进行检测：A.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕，凝胶成像系统拍照成像，如果电泳结果呈现LAMP典型的梯状条带，则说明水稻或水稻加工品中含有Bt基因；B.取15μL反应产物，加入2μL SYBR Green Ⅰ染料，片刻后对结果直接进行可视化观察，若反应液显示绿色荧光，则样品中含有Bt基因，若显示浅橙色则为阴性结果。

其中，所述的水稻加工品优选大米、米饭或米酒。

所述的LAMP反应体系为：10×Thermopol Reaction Buffer2.50μL，25mM MgCl₂3.00μL，20mM dNTPs3.50μL，8U/μL Bst DNA聚合酶0.80μL，20μM上游内引物FIP1.60μL，20μM下游内引物引物BIP1.60μL，10μM上游外引物F30.25μL，10μM下游外引物B30.25μL，5M甜菜碱1.00μL，100ng/μL DNA模板1.00μL，无核酸酶纯水9.50μL，共计25μL。

所述的LAMP反应程序为：61℃恒温反应60min，80℃保温10min终止反应。有益效果：

本发明通过一系列的LAMP反应体系、反应条件优化实验及引物特异性实验，成功地建立了米制品中Bt基因的LAMP快速检测方法，检出限达到0.005%，该法具有操作简单、不需要特殊仪器、结果易于观察的优点，适合于基层推广。

并且，考虑到水稻加工品加工过程中DNA的降解，本发明设计的LAMP引物能够将扩增片段的大小控制在合适的范围,避免扩增片段大导致假阴性结果和扩增片段小降低反应特异性的缺点。

附图说明

图1用于LAMP引物设计的部分Bt基因序列。

图2LAMP检测转基因水稻的特异性试验检测结果，其中M：DNA marker；1；转基因水稻2：非转基因水稻；3：空白对照。