[发明专利]发酵法生产α-酮戊二酸的残糖控制方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及发酵过程控制，特别是一种发酵工程中残糖的控制策略，应用于α-酮戊二酸的发酵法生产。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，也称2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是分子式为C₅H₆O₅、相对分子质量为146.1的白色或微黄色的结晶，其化学结构式如下：

α-酮戊二酸化学结构式。

作为三羧酸循环(TCA)和氨基酸代谢的重要中间产物之一，α-酮戊二酸参与生物体内氨基酸、维生素和有机酸的合成及能量代谢。迄今为止，α-酮戊二酸已被广泛应用于化工、食品、医药、日化等领域，由此可见，该化合物在营养食品，医药，化工等领域具有非常重要的应用前景。现在，α-酮戊二酸主要被应用于：作为杂环化合物化学合成的反应骨架；食品营养改善物；医药制品的组成成分，生化试剂和检测肝功能的配套试剂以及伤口愈合添加物；α-酮戊二酸与5-羟甲基糠醛一起作用能够增强人或者动物抗氧化能力；此外，Barrett和Yousaf等人描述的α-酮戊二酸与1,2,4-丁三醇或1,2,6-己三醇的热缩聚产物(triol-α-ketoglutarate)具有很好的弹性，其在机械和化学领域有很广泛的应用，该性能可能使其在生物医药拥有新的应用的潜能，例如在组织工程和药物传送方面等；有研究表明，α-酮戊二酸作为氮素运载体，能够结合细胞中形成的氮素，阻止细胞中氮素的过度累积。

随着α-酮戊二酸应用范围的不断扩大，其市场需求也在不断增长，而目前市场上α-酮戊二酸的生产主要是通过化学合成的。主要以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，合成α-酮戊二酸，具有收率高、副产物少、反应条件温和、易于工业化放大等优点。但是在原料来源和安全生产上存在一定的问题，主要存在爆炸的危险，此外，化学合成对环境污染大以及生产过程中对人的身体危害十分大。因此，利用微生物发酵法生产α-酮戊二酸具有重要的意义。

对于利用微生物发酵生产α-酮戊二酸的研究，最早见于1946年，Lockwood和Stodola用细菌生物合成α-酮戊二酸。之后，Asai等人利用假单胞杆菌、产气杆菌和粘质沙雷氏菌过量合成α-酮戊二酸，并且提出过量合成α-酮戊二酸的必要条件是培养基中碳氮比。

目前国内对发酵法生产α-酮戊二酸的研究较少。江南大学陈坚等人筛选的解脂亚洛酵母（Yarrowia lipolytica WSH-Z06），液态发酵6天，α-酮戊二酸产量可达39.3g/L。但该方法发酵周期长,且操作复杂。

发明内容

本发明的目的是解决现有发酵生产α-酮戊二酸的方法所需周期长以及产酸率不高的问题，提供一种发酵法生产α-酮戊二酸的残糖控制方法。

本发明涉及的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047，保藏编号为CGMCC No.5481，已于2011年11月22日保藏并在2011103927788号专利中公开。

本发明的技术方案是，以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047为生产菌株，发酵生产α-酮戊二酸，发酵时间35～40h，初始发酵时(0h)，发酵液中底糖浓度为7%～9%，菌体利用过量的葡萄糖合成自身生长所需物质；发酵过程中（产酸阶段），控制发酵液中的残糖浓度，使其质量浓度维持在3%～2%，发酵后期，即发酵30h至发酵结束，发酵液中残糖应该严格高于1%。

本发明方法在长菌阶段，菌种利用基质中大量的葡萄糖快速生长，形成较高的菌体浓度，转型后的产酸阶段，菌体保持较高活性，由于合适的碳氮比，菌体利用葡萄糖合成α-酮戊二酸，同时保持发酵液中一定的残糖浓度，使得菌体不利用发酵液中的α-酮戊二酸产物，从而达到过量积累α-酮戊二酸的目的。

本发明方法的具体操作如下，以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养12～14h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至含底糖为7%～9%的发酵培养基的发酵罐中，34℃，开始发酵；以后每两个小时取样，检测发酵液的残糖浓度，通过流加90%～70%的口服葡萄糖溶液，使得发酵液中残糖浓度维持在3%～2%，发酵后期，即发酵30h至发酵结束，发酵液中残糖应该严格高于1%。

上述方法中：

⑴斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2；