[发明专利]p66Shc重组腺病毒载体及构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及p66Shc重组腺病毒的构建及应用，是利用分子克隆技术、包括PCR扩增基因、体外重组连接等，获得能够感染各种细胞的p66Shc重组腺病毒载体，探讨了此载体对人子宫颈癌细胞(Hela细胞系)和人脐静脉内皮细胞增殖的不同影响，为进一步研制可特异性抑制肿瘤细胞生长的腺病毒基因治疗制剂奠定了实验基础。

背景技术

p66Shc是调控哺乳动物细胞氧化应激及生命周期信号转导途径的关键蛋白，由原癌基因ShcA编码(Biochim Biophys Acta，1797，952-960(2010))。p66Shc蛋白含有几个基本功能区：1)N末端磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)，在其36位氨基酸上有一个磷酸化丝氨酸残基及一个与线粒体细胞色素C结合区(CB)。它们是诱导线粒体细胞ROS产生的关键位点与区域，在调控细胞氧化应激及凋亡反应中起关键作用(Arch Biochem Biophys，486，73-80(2009))；2)C端Src同源2区(SH2)；3)中央富含脯氨酸结构域(CH1)；4)N’端富含脯氨酸结构域(CH2)(Trends Biochem Sci，21，257-261(1996)；J Biol Chem，272，28042-28049(1997)；EMBO J，16，706-716(1997))。李西川等研究发现小细胞肺癌是肺癌中恶性程度最高的一种，转移快，存活率低。他们发现ShcA家族中的成员p66Shc在小细胞肺癌细胞中表达缺失，将p66Shc基因导入p66Shc表达缺失的鼠肺癌细胞中并通过鼠尾静脉注射入小鼠体内，能够100％抑制肿瘤细胞的转移，说明p66Shc的缺失是小细胞肺癌细胞转移的主要原因。另有报道p66Shc是调节氧化应激下凋亡应答和衰老信号转导途径的重要基因，可通过引起线粒体中活性氧自由基产生导致细胞氧化损伤，敲除p66Shc可增强细胞对氧化应激的抵抗能力，如Menini等发现，p66Shc基因敲除鼠，可减少STZ诱导的1型糖尿病肾病肾组织的氧化损伤，保护肾脏组织结构和功能，降低蛋白尿，抑制NF-KB的活性，降低AGE的形成(Diabetes，55，1642-1650(2006))。而p66Sh c的过表达则与机体内氧化应激的增加密切相关(Cell，122，221-233(2005)；Nature，402，309-313(1999)；PNAS，107，13420-13425(2010))。另外，高葡萄糖，血管紧张素II(Ang II)可诱导p66shc磷酸化，通过PKCβ-p66Shc-P1n1-CytC信号通路，导致小管细胞损伤(Am J Physiol Renal Physiol，299，F1014-1025(2010))。根据这些报道，目前认为p66Shc基因与细胞内活性氧水平密切相关，而对于p66Shc基因对于细胞增殖方面的作用还未见报道。

本发明利用分子克隆技术、包括PCR扩增基因、体外重组连接等，获得能够感染各种细胞的p66Shc重组腺病毒载体，探讨了此载体对人子宫颈癌细胞(Hela细胞系)和人脐静脉内皮细胞的增殖的不同影响，为进一步研制可特异性抑制肿瘤细胞生长的腺病毒基因治疗制剂奠定了实验基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种p66Shc重组腺病毒载体，所述载体的核苷酸序列SEQ ID NO：1。

本发明的另一个目的是提供上述载体的构建方法，通过以下步骤获得：

(1)获取目的基因

将含有质粒pcDNA3.1his p66shc的菌株涂布于抗生素平板，筛选阳性克隆，挑取单个克隆于LB培养基中振荡生长至OD₆₀₀值0.8，离心收集菌体，用无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN)提取质粒，以所提质粒为模板进行PCR扩增获得p66Shc，再用琼脂糖胶回收法纯化目的基因。获得的目的基因p66Shc的两侧分别含有与pAdeno X-CMV上重组位点两端同源的15bp碱基对。用于扩增的上下游引物(由Invitrogen合成)分别为：上游引物(SEQ ID NO：2)：

5’gtaactataacggtcatggatct cctgccc-3’；下游引物(SEQ ID NO：3)：

5’-attacctctttctcctcac agtttccgctcca-3’，用于扩增的聚合酶为PrimeSTAR HS DNA polymerase with GC Buffer(TaKaRa)。