[发明专利]一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种融合蛋白的制备方法，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的制备方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌，在其芽孢的形成过程中，会形成具有杀虫活性的晶体蛋白（Cry蛋白）。该蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种害虫具有较高的毒性，是应用最为广泛的毒蛋白。由于此特性，编码Cry蛋白的基因被生物学者认作是转基因作物的热门备选基因，并已有多个转基因作物品种转入该基因并商品化，在全球范围内广泛种植。Bt菌系含有大量不同的杀虫晶体蛋白编码基因，至今已有近180个不同的Bt杀虫晶体蛋白基因被克隆和测序，cry34B就是其中一种。

转基因作物的种植满足了人类对粮食产量、经济效益需求。同时，也存在着环境安全风险，外源基因导入的随机性和不确定性，基因表达对作物的生理生化作用的改变，对生态环境构成的威胁等等都难以预测。人们对转基因作物的安全性存在担忧，而消除这一担忧的有效途径就是对转基因作物所表达的外源蛋白进行安全性评价。因此，获取各种Bt杀虫晶体蛋白基因所表达的外源蛋白，对进行安全性评价意义重大，为后续的检验方法建立、检测标准的实施提供基础，从而可以有效防止安全隐患的发生，避免转基因作物对生态环境的破坏，充分发挥转基因技术在农业生产上的巨大应用潜力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的编码基因。

本发明所提供的苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的编码基因，具有序列表中SEQ ID №：1中第5179-5574位核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白的编码基因，具有序列表中SEQ ID №：1中第5071-5601位核苷酸序列。

含有上述苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B和晶体融合蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体优选为重组表达载体或重组克隆载体。

本发明的另一个目的是提供一种Bt Cry34B融合蛋白的制备方法。

本发明所提供的Bt Cry34B融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）将SEQ ID №.1中第5173-5580位核苷酸所示的DNA插入pET28a表达载体中，得到重组表达载体；

2）将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21（DE3），得到重组菌；

3）培养所述重组菌，并进行诱导表达，收集菌体；裂解菌体，即得。

Bt Cry34B融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID №：2所示，共有176个氨基酸残基，包括苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Bt Cry34B的氨基酸序列和组氨酸标签序列。

上述方法中，所述步骤3）包括以下步骤：

a）将所述重组菌接种于含有50ug/mL Kan的LB培养基，37℃振荡培养16h，得到培养物；

b）将所述培养物按1%的体积接入含50ug/mL Kan的LB培养基，37℃振荡培养3小时，得到培养液

c）向所述培养液中加入IPTG至终浓度为1mM，30℃震摇培养6小时；

d)将步骤c）所得产物4℃，10000g离心10min，收集菌体。

氨基酸序列如SEQ ID №.2所示的蛋白也属于本发明的保护范围。

本发明的表达载体含有T7lac启动子，受乳糖操纵子调控，它的调控快速而灵敏。

本发明方法克服了苏云金杆菌晶体蛋白表达提取烦琐、成本高的缺陷，具有简便、快捷和高效的特点。

本发明应用基因工程方法在国内首次合成Bt Cry34B基因，并首次制备出了Bt Cry34B融合蛋白，为进一步探讨该蛋白的检测方法、生理功能及其作用机制、降解机制打下了基础。

附图说明

图1为Bt Cry34B融合蛋白SDS-PAGE图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1、Bt Cry34B融合蛋白的制备方法