[发明专利]一种提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种重要的致病菌，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)在金黄色葡萄球菌中的分离率已超过50%，与其相关的死亡率及治疗费用显著增加。用分子生物学方法可以在数小时内对MRSA进行快速诊断，但是其工作基础是MRSA基因组DNA的提取。金黄色葡萄球菌属革兰氏阳性细菌，其细胞壁较厚（20-80nm），有5-15层肽聚糖，而革兰氏阴性细菌细胞壁仅8-11nm，只有1-2层肽聚糖。如果细菌裂解不完全，DNA未释放，或裂解后的样本中含有聚合酶链反应（PCR）抑制物，则可导致假阴性结果，显著降低检测灵敏度。因此用分子生物学方法检测病原菌，其灵敏度一定程度上有赖于样本制备的效果。

目前国内外有商品化试剂盒可以提取细菌DNA用于后续PCR反应，但其检测金黄色葡萄球菌灵敏度为10⁵-10⁶CFU，部分只有 10⁷-10⁸CFU，且提取步骤复杂，涉及多次离心、上清过柱、洗涤等步骤。也有文献报道了一些提取细菌基因组DNA的方法，都需要酚/氯仿等抽提步骤，存在有害化学品的危害，并因为有“转移上清”等步骤而损失样本，且步骤多、耗时长。

由此可见，目前的技术手段存在过程复杂；耗时长；含有害化学品；灵敏度有限等不足，因此，为满足临床MRSA快速诊断的要求，PCR反应的样本制备需要快速地获取高质量的DNA。

发明内容

针对上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速提取MRSA DNA的方法，获得的DNA可直接用于实时定量PCR反应。

为了实现本发明目的，本发明提供一种提取MRSA DNA的方法，其包括如下步骤：

1）裂解液的配置：

称取Tris(三羟甲基氨基甲烷，分子量121.14)、Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠盐，分子量336.21)、chelex100(弱阳离子螯合树脂)、溶菌酶(lysozyme)、溶葡萄球菌酶(lysostaphin)和蛋白酶K溶于适量无菌水中，再加入Triton x-100溶液，调整PH值至8.0，用无菌水定容。

溶液终浓度如下(pH8.0)：20mM (即mmol/L)Tris(三羟甲基氨基甲烷); 2 mM Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠盐); 1.0%(v/v) Triton x-100; 20mg/ml溶菌酶(lysozyme); 0.05g/ml-0.15g/ml chelex100(弱阳离子螯合树脂); 90ug/ml -100ug/ml溶葡萄球菌酶(lysostaphin); 1.8mg/ml -2mg/ml蛋白酶K; 其余为无菌水；

2）取5-10个生长于血平板上的金黄色葡萄球菌菌落，混悬于100ul上述裂解液中，56℃ 30min，100℃ 10min，12000rpm离心10min；

3）最后取上清液。

其中，优选的裂解液组分为：20mM Tris; 2mM Na2-EDTA; 1.0%Triton x-100; 20mg/ml溶菌酶; 0.1g/ml chelex100; 100ug/ml溶葡萄球菌酶; 2mg/ml蛋白酶K; 其余为无菌水; pH8.0。

本发明还提供一种用于提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA的裂解液，其所含的成分为：20mM Tris; 2mM Na2-EDTA; 1.0%Triton x-100; 20mg/ml溶菌酶; 0.1g/ml chelex100; 90ug/ml-100ug/ml溶葡萄球菌酶; 1.8 mg/ml -2mg/ml蛋白酶K；其余为无菌水； pH8.0。

其中优选的为：20mM Tris; 2mM Na2-EDTA; 1.0%Triton x-100; 20mg/ml溶菌酶; 0.1g/ml chelex100; 100ug/ml溶葡萄球菌酶; 2mg/ml蛋白酶K; 其余为无菌水; pH8.0。

本发明所述的裂解液可用于提取MRSA的DNA。

本发明采用酶学方法裂解MRSA的细胞壁，从而为用分子生物学方法检测MRSA奠定基础，本发明提取MRSA DNA的方法，能快速获取适合于PCR反应的DNA，具有以下优点：