[发明专利]一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法

权利要求书

1.一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法，其特征在于利用FLAG标签亲和层析原理，从大量的细胞破碎液上清中分离出易降解的多亚基调节蛋白RAVE复合物。

2.按照权利要求1所述，其特征在于利用FLAG标签亲和层析原理，从大量的细胞破碎液上清中分离出易降解的多亚基调节蛋白RAVE复合物，包括如下步骤：

A、大量培养酿酒酵母重组菌株BY4742rav2-FLAG：

(1)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742rav2-FLAG单菌落，接种于种子培养液，培养至对数期中期；

(2)将种子培养液转接至装有YPD培养基扩大培养稳定期中期。

B、收集并破碎细胞：

(1)室温离心收集细胞，并用无菌水重悬细胞，室温孵育5min；

(2)4℃离心收集细胞，用破碎缓冲液重悬细胞；

(3)用高压匀浆机充分破碎细胞，并添加苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制剂试剂。

C、细胞破碎液的前处理：

(1)调节细胞裂解液pH至7.4；

(2)细胞裂解液离心收集上清液；

(3)上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除去不可溶性蛋白。

D、上样与洗涤：

(1)上清液过1mL用anti-FLAG凝胶填装的重力柱；

(2)用大量破碎缓冲液充分洗涤去除非特异性结合的蛋白。

E、洗脱：

用5倍柱体积的洗脱液分批次洗脱得到RAVE复合物。

F、蛋白凝胶电泳：

每批次洗脱液取样进行蛋白凝胶电泳。