[发明专利]一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及酿酒酵母中RAVE复合物蛋白的修饰与纯化，属于分子生物学及蛋白组学领域。

背景技术

V-ATP酶(VacuolarATPases)主要存在于真核生物内膜系统内，如溶酶体、内涵体、高尔基体、液泡、细胞质膜。V-ATP酶可以利用水解ATP的能量来转移质子，维持细胞内不同部位的酸碱环境平衡，进而参与诸多生理代谢活动，例如细胞的内吞作用、蛋白的分泌与储存、细胞内膜的融合与运输、Na⁺的重吸收、免疫反应、精子的发育成熟、细胞自噬、破骨细胞的重吸收、神经递质的分泌等生理过程。V-ATP酶由两大结构功能部分共14种亚基组成：一部分是水溶性的V₁，由8种亚基组成，主要负责水解ATP；另一部分是嵌于膜中的V₀，由6种亚基组成，主要负责转移质子。这两大部分结合形成一种柄状结构从而形成一个具有生物活性的整体。

当细胞外环境中葡萄糖耗尽时，V-ATP酶分解为单独的V₁与V₀，补充葡萄糖后，V₁与V₀又迅速结合组装成具有活性的整体。2001年，首次发现一种调节V-ATP酶的V₀和V₁两部分可逆组装的蛋白复合物，并命名为RAVE(regμlator of the H⁺-ATPase of vacuolar and endosomal membranes)。RAVE复合物由Skplp、Ravlp和Rav2p三个亚基组成，Ravlp可以特异性地结合V₁部分的Vma4p(E亚基)、Vma10p(G亚基)；Rav2p特异性地结合Vma4p(C亚基)；当V₁与V₀组装完成后，Skplp促使RAVE从细胞膜上脱离，以便进行下一次循环。但是由于RAVE属于调节蛋白，在细胞内的含量并不丰富，并且其中Ravlp与Rav2p亚基容易降解，这使得纯化RAVE变得非常困难，这也使得近年来对RAVE复合物的研究难以取得实质性进展，特别是其三维结构。

本发明人利用研究室构建的酿酒酵母重组菌株BY4742rav2-FLAG作为生产菌株，通过FLAG标签的亲和层析原理，从细胞破碎液上清中分离出RAVE复合物，为后续研究复合物的结构打下了坚实基础。这也有利于深入了解V-ATP酶的活性调节机制及其质子转运机制，由于V-ATP酶具有众多的生理作用，使得RAVE复合物具有重大的研究价值。本发明正是提供了一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法。该方法切实可行，已经过实验结果的验证。

本发明提供了一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法，其特征在于利用FLAG标签亲和层析原理，从大量的细胞破碎液上清中分离出易降解的多亚基调节蛋白RAVE复合物。

一种利用FLAG标签从酿酒酵母细胞中分离RAVE复合物的方法，其步骤如下：

A、大量培养酿酒酵母重组菌株BY4742rav2-FLAG：

(1)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742rav2-FLAG单菌落，接种于200ml的YPD液体培养基，在30℃200rpm条件下，培养至对数期中期(OD≈1)；

(2)将种子培养液转接至装有1LYPD液体培养基的3L三角烧瓶中，在30℃200rpm条件下培养过夜至稳定期中期(OD≈3.5)。

B、收集并破碎细胞：

(1)在8000xg室温条件下离心5min收集细胞，并用25℃的无菌水重悬细胞，室温放置5min；

(2)在8000xg4℃条件下离心5min收集细胞，用预冷的(4℃)破碎缓冲液TBSE(50mM Tris/Cl，150mM NaCl，1mM EDTA，pH7.4)重悬细胞(按细胞湿重质量分数为20％重悬细胞)；

(3)使用高压匀浆机在25,000P.s.i压力下破碎细胞，破碎三次，每单位OD添加10μL1mM苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制剂试剂。

C、细胞破碎液的前处理：

(1)调节细胞裂解液pH至7.4；

(2)细胞裂解液在20000xg4℃条件下离心20min，收集上清液；

(3)上清液用0.22μm滤膜过滤除去不可溶性蛋白。

D、上样与洗涤：