[发明专利]一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法

权利要求书

1.一株耐冷冻面包酵母菌株，具体为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14AΔU，保藏编号为CGMCC No.7379。

2.如权利要求1所述的一株耐冷冻面包酵母菌株，其特征在于，所述面包酵母菌株发酵后胞内海藻糖含量占细胞干重11.7％；细胞在液体面团中冷冻21天后，存活率达到78％，是亲本菌株的2.6倍。

3.如权利要求1所述的一株耐冷冻面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过融合PCR技术和整合型载体质粒YIplac211介导的两步基因整合法，将编码中性海藻糖酶的基因NTH1无痕敲除来实现的。

4.如权利要求3所述的一株耐冷冻面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到面包酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；用PCR方法分别扩增敲除靶基因NTH1上游和下游、长度为0.5～2.0kb的同源序列片段，然后通过融合PCR，将上、下游序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入面包酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；用PCR方法获得出发菌株正常的URA3基因片段，将其导入到发生了二步整合重组的酵母突变株中，以回复突变的ura3标记基因。

5.如权利要求1或2所述的一株耐冷冻面包酵母菌株在面包生产中的应用。