[发明专利]一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法。 

背景技术

面包酵母(Baker’s Yeast，学名Saccharomyces cerevisiae)是一种重要的工业微生物，含有丰富的营养成分，是馒头、面包、饼干等面食生产过程中最重要的微生物发酵剂、生物疏松剂和生物营养剂。随着冷冻面团生产技术的迅速发展，耐冷冻面包酵母及其耐冷冻机制得到了广泛研究，在欧美、日本等发达国家，冷冻面团技术也已广泛应用于焙烤工业。普通面包酵母的耐冷冻性差是限制冷冻面团技术发展的主要因素。海藻糖是酵母细胞内一种自身保护剂，可以保护细胞在冷冻过程免受冻伤。增加酵母胞内海藻糖含量可以提高面包酵母的耐冷冻性能。但是随着公众对食品安全的关注，通过传统遗传学方法构建的菌株，由于残留非自身的外源基因，其生产应用受到限制。因此有必要对酵母进行无痕基因敲除，以保证不会留下任何外源DNA。 

酵母菌的无痕修饰起初是为了除去筛选标记，以便在单个菌株中进行多基因操作。去除筛选标记主要有两种方法，一种是在靶基因敲除后，利用敲除元件中正向重复序列(hisG)之间的同源重组。另一种则是利用重组酶介导的敲除系统，例如Cre/Loxp系统等。利用第一种方法，首先需要构建带有“hisG-URA3-hisG”的质粒，然后使用长引物直接PCR得到敲除元件，通过转化敲除目的基因后，再反向筛选，利用正向重复序列(hisG)之间的同源重组去除筛选标记。此法中长引物包含两部分序列，一部分是与质粒退火的序列，另一部分是与靶基因两侧的侧翼序列相同的基因序列。通过这种方法得到的转化子，其基因组的靶位置上，会残留一个重复序列。利用第二种方法，通过转化筛选标记两侧带有重组酶位点的敲除元件到酵母中，一步整合实现目的基因的敲除，然后转化另一个编码重组酶的质粒，以实现抗性标记的去除。在工业酵母的改造中，这个系统具有很高的效率，但是其仍会留下外源序列(单一loxp位点)，并且在进行多基因敲除时，留下的这些位点增大了发生染色体重排的可能性。2006年，日本学者使用带有靶基因一侧40bp重复序列的长引物，通过融合PCR构建的无痕敲除元件，可以 方便的实现重组，并且不会留下外源基因。但是这种方法中，40bp的重复序列重组效率较低。总之，本领域仍需要一种高效的无痕基因敲除方法。 

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案： 

本发明提供的面包酵母菌株是具有快速发酵性能的耐冷冻面包酵母菌株，具体为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14aΔU。该菌已于2013年3月28保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路甲3号)，保藏编号为CGMCC No.7379。 

所述面包酵母菌株在其他发酵性能不受影响的情况下，发酵后胞内海藻糖含量占细胞干重11.7％，较亲本菌株提高了134％，细胞在液体面团中冷冻21天后，存活率达到78％，是亲本菌株的2.6倍。 

所述面包酵母菌株具体可以通过对出发菌株面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616(中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可以通过该保藏管理中心获得出发菌株CICC31616)的中性海藻糖酶编码基因NTH1的全部序列进行无痕敲除来实现。 

上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。