[发明专利]一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法

权利要求书

1.一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）DNA的提取：提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；

2）SSR标记引物的筛选：以亲本材料筛选SSR标记引物；

3）PCR扩增：分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；

4）图谱构建：利用生物学软件分析PCR扩增结果，在5%的显著水平下下找到偏分离标记并去除，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。

2.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中所述待测枣树亲本是以冬枣为母本，以映山红为父本；所述子代为149株F₁代的子代。

3.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下：

（1）取适量CTAB提取液放入65℃水浴锅中预热待用；

（2）取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有1ml65℃预热的CTAB提取液的离心管中；

（3）旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65℃水浴锅中，水浴50min，每隔10min上下翻动离心管，充分混匀；

（4）12000rpm常温下离心10min；

（5）取上清液于新的离心管中，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液，其配比为25：24：1，轻轻颠倒混匀，室温放置10min；

（6）12000rpm常温下离心10min；

（7）取步骤（6）所得上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，其配比为24：1，再次抽提；

（8）取步骤（7）所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于-20℃冰箱中沉淀20min；

（9）挑出DNA絮状沉淀到2ml离心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min；

（10）在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入100μl TE缓冲液溶解DNA，于-20℃保存待用。

4.根据权利要求2所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2）中所述SSR标记引物为表3中所示的240对引物；所述步骤2）中所述SSR标记引物的筛选基于磁珠富集法，开发冬枣SSR引物，利用母本冬枣和父本映山红进行SSR标记引物筛选，挑选母本冬枣和父本中至少一方表现为杂合的引物作为核心引物。

5.根据权利要求4所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述核心引物为表3中所示的170对核心引物。

6.根据权利要求4或5所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤2）包括检测提取的DNA的质量。

7.根据权利要求6所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3）PCR扩增采用的是三引物法，即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型M13引物。

8.根据权利要求7所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤3）PCR扩增之后还包括对PCR扩增后的结果进行检测，采用毛细管电泳检测。

9.根据权利要求8所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4）中所述生物学软件为Genemarker V1.75软件，读取后的数据经过FlexiBinv2程序矫正后用于后续分析。

10.根据权利要求1所述的枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤4）中分别对PCR扩增结果进行χ2检验，分析其是否符合孟德尔分离定律，在5%的显著水平下找到偏分离标记并去除，分别将三种分离形式：1:1、1:2:1、1:1:1:1的标记类型转化为统一的格式，选用全同胞群体遗传图谱构建软件FslinkageMAP进行分子遗传图谱的构建。