[发明专利]一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、遗传学和基因组学领域，特别是指一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法。

背景技术

枣树属于鼠李科枣属，是原产我国的特有果树，种质资源极其丰富，遗传背景复杂，迄今至少已有7000年的栽培历史。在长期的自然演化和人工选择过程中，形成了丰富的变异，至今已经发现和记载的枣树品种和优良类型达880多种。但是由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究相对比较滞后。

申莲英构建了第一个枣树分子遗传图谱(申连英.2005.枣(Ziziphus jujuba Mill)遗传连锁图谱构建及性状的QTL定位研究)，包括分布在14个连锁群的333个AFLP(amplified fragment length polymorphism限制性片段长度多态性标记)标记，覆盖基因组长度1237.4cM，平均图距为3.9cM。齐靖等(齐靖，董祯，毛永民，等.枣高密度遗传图谱的构建与树干直径的QTL分析.林业科学，2009，45(8)：44-49)对该图谱进行加密至388个AFLP标记和35个RAPD(random amplified polymorphic DNA即随机扩增多态性DNA标记)标记由15个连锁群，覆盖基因组总长度1309.4cM，标记间平均距离3.1cM。但该图谱缺乏通用性的共显性标记，相对难以进行整合。因此，以共显性SSR标记构建框架遗传图谱，对枣树分子育种的发展具有重要的意义。

RAPD、AFLP和SRAP(Sequence-related amplified polymorphism即相关序列扩增多态性)标记等被用于枣树的品种分类和亲缘关系分析。但这些标记由于显性特点等原因，加上新的标记的出现，渐渐较少用于遗传图谱构建。SSR(Simple sequence repeat简单重复序列)标记，又叫微卫星(Microsatellites)标记，具有数量丰富、共显性、重复性、实验技术简便等突出的优点，因此越来越多的作为锚定标记被应用到众多物种的遗传图谱构建，尤其是框架遗传图谱构建。此外，SSR还被广泛应用于遗传多样性分析、指纹图谱、遗传图谱的构建中。本发明人利用磁珠富集法开发了冬枣SSR标记引物240对，筛选其中的多态引物构建枣树的分子遗传图谱，从而进行相关性状的QTL定位，可以推动枣树重要性状的遗传控制研究和分子标记辅助育种的进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法。

一种枣树SSR标记分子遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)DNA的提取：提取待测枣树亲本和子代的基因组DNA；

2)SSR标记引物的筛选：以亲本材料筛选SSR标记引物；

3)PCR扩增：分别利用上述SSR标记引物，各自以待测枣树亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；

4)图谱构建：利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建枣树SSR标记分子遗传图谱。

其中，所述步骤1)中所述待测枣树亲本是以冬枣为母本，以映山红为父本；所述子代为149株F₁代的子代。

其中，所述步骤1)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具体步骤如下：

(1)取适量CTAB提取液放入65℃水浴锅中预热待用；

(2)取枣树叶片0.5g，放入研钵中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有1ml65℃预热的CTAB提取液(用前加2％β-巯基乙醇混匀)的离心管中(用前做灭菌处理)；

(3)将所述离心管旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65℃水浴锅中，水浴50min，每隔10min上下翻动离心管助充分混匀；

(4)12000rpm常温下离心10min；

(5)取上清液于新的离心管中(注意吸取时不要触及分界面，以免带入杂质)，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(25∶24∶1)(现用现配)，轻轻颠倒混匀，室温放置10min；

(6)12000rpm常温下离心10min；

(7)取步骤(6)所得上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)再次抽提；

(8)取步骤(7)所得上清液于新的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于-20℃冰箱中沉淀20min；