[发明专利]一种海洋芽孢杆菌及其产生的具有抗肿瘤活性的多肽

权利要求书

1.一种海洋芽孢杆菌，其特征在于它是从海水中培养分离得到，能产新型抗肿瘤物质，该菌株命名为海洋芽孢杆菌N16（Bacillus sp.N16），该海洋芽孢杆菌N16于2013年3月4日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013063。

2.本发明还提供一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌N16多肽，该多肽分子量为1015Da，由9个氨基酸组成，氨基酸序列为Arg-Cys-Phe-Ser-Ile-Met-Ser-Asp-Arg。

3.本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其步骤为：

（1）发酵培养

将海洋芽孢杆菌N16发酵，发酵条件：发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏4-6g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠4-7g/L、pH7.0-7.6，灭菌1.05kg/cm²，20-35min，150-250r/min、25℃的条件下在旋转摇床中培养20-33h；

（2）超滤分离

将海洋芽孢杆菌N16的发酵液，分批次离心，8000-10000g，5-10min，收集上清液，用分子量为0.3kDa、5kDa和50kDa的超滤膜超滤，获得分子量0.3-5kDa和5-50kDa的不同组分，检测各组分的抗肿瘤活性，结果表明分子量0.3-5kDa组分的抗肿瘤活性最佳；

（3）二乙氨乙基，简称DEAE，FF阴离子交换层析

将超滤获得的具有最佳抗肿瘤活性的组分，过DEAE FF阴离子交换层析预装柱，上样缓冲液为3-6mmol/L pH8.0-9.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，每次上样量为5-20ml，洗脱液为含0.5-2mol/L NaCl的3-6mmol/L pH8.0-9.5 Tris-HCl，洗脱液以0-100%(v/v)的浓度进行梯度洗脱，流速为3-6mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存；

（4）Superdex30凝胶过滤层析

取DEAE收集的具有较好抗肿瘤活性峰的组分，过Superdex30凝胶过滤预装柱，每次上样量为1-10ml，流动相为超纯水，流速为1-5ml/min，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N16多肽。

4.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于所述的抗肿瘤活性的检测方法为以肝癌细胞BEL-7402为靶细胞，采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分。

5.根据权利要求4所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于所述的MTT法：取对数生长期的肝癌细胞BEL-7402，用胰酶消化后，以4×104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔180μL，在37℃，培养24h，然后加样，样品溶液应先经过微孔滤膜过滤除菌，用培养液将样品稀释成5个浓度梯度，每孔加入20μL，4个平行孔，置于细胞培养箱中继续培养48h，然后，加入5mg/mL MTT 20μL，置CO₂培养箱37℃培养4h；弃除孔中培养液，然后每孔加入DMSO 150μL，37℃恒温振荡30min以充分溶解甲瓒结晶，酶标仪检测各孔在570nm波长处吸光度值，实验至少重复3次；细胞抑制率=［(A对照-A样品)/A对照］×100%，其中A为吸光度值；采用Excel分析软件计算半数抑制浓度IC50。

6.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于上述步骤（3）中的洗脱液中NaCl的浓度为1mol/L。

7.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于上述步骤（3）中的洗脱液的流速为5.0mL/min，每次上样量为10mL。

8.根据权利要求3所述的一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其特征在于上述步骤（4）中每次上样量为5mL，流动相为超纯水，流速为2.6mL/min。

9.本发明还提供一种抗肿瘤药物，该药物包含海洋芽孢杆菌N16多肽。

10.本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽在肿瘤治疗药物中的应用。