[发明专利]一种海洋芽孢杆菌及其产生的具有抗肿瘤活性的多肽

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物领域，具体地涉及一种生产抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌及其产生的具有抗肿瘤活性的多肽。 

背景技术

当今社会，恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是人类社会的第一杀手。临床上恶性肿瘤治疗手段多是采用综合疗法，以手术切除、放疗、化疗和免疫治疗相结合。目前已使用的抗肿瘤药物虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在着治疗有效率低、选择性差、毒副作用明显、易产生细胞耐药等问题。因此，寻找高效、低毒、作用靶点明确的抗肿瘤药物仍是生物、医学科研领域的研究热点。 

由于海洋独特的地理、气候及环境特点，海洋生物具有的新颖性与多样性，在科学研究、应用开发等方面都具有重要价值。海洋因此被认为是个潜在、重要的生物资源库，可能是产生新型生物活性物质和先导化合物的潜在种源地，将会给新型天然药物的筛选与发现带来新的机遇与突破。海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的抗肿瘤代谢产物，它们多为生物碱类、萜类、大环内酯类化合物，主要来源于海洋放线菌和海洋真菌。但是来源于海洋细菌的抗肿瘤先导化合物研究的相对较少，有待于在这方面做深入的研究。 

发明内容

本发明的要解决的技术问题是提供一种产抗肿瘤活性物质的海洋芽孢杆菌N16（Bacillus sp.N16）；该菌株能够产生具有抗肿瘤活性的多肽。 

一种海洋芽孢杆菌，是从海水中培养分离得到产新型抗肿瘤物质的海洋芽孢杆菌，命名为海洋芽孢杆菌N16（Bacillus sp.N16），该海洋芽孢杆菌N16于2013年3月4日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013063。 

本发明还提供一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌N16多肽，该多肽分子量为1015Da，由9个氨基酸组成，氨基酸序列为Arg-Cys-Phe-Ser-Ile-Met-Ser-Asp-Arg。 

本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N16多肽的筛选方法，其步骤为： 

（1）发酵培养 

将海洋芽孢杆菌N16发酵，发酵条件：发酵液中各成分的终浓度为牛肉膏4-6g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠4-7g/L、pH7.0-7.6，灭菌1.05kg/cm²，20-35min，150-250r/min、25℃的条件下在旋转摇床中培养20-33h； 

（2）超滤分离 

将海洋芽孢杆菌N16的发酵液，分批次离心，8000-10000g，5-10min，收集上清液，用分子量为0.3kDa、5kDa和50kDa的超滤膜超滤，获得分子量0.3-5kDa和5-50kDa的不同组分，检测各组分的抗肿瘤活性，结果表明分子量0.3-5kDa组分的抗肿瘤活性最佳； 

（3）二乙氨乙基（DEAE）FF阴离子交换层析 

将超滤获得的具有最佳抗肿瘤活性的组分，过DEAE FF阴离子交换层析预装柱，上样缓冲液为3-6mmol/L pH8.0-9.5三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液，每次上样量为5-20ml，洗脱液为含0.5-2mol/L NaCl的3-6mmol/L pH8.0-9.5 Tris-HCl，洗脱液以0-100%(v/v)的浓度进行梯度洗脱，流速为3-6mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存； 

（4）Superdex30凝胶过滤层析 

取DEAE收集的具有较好抗肿瘤活性峰的组分，过Superdex30凝胶过滤预装柱，每次上样量为1-10ml，流动相为超纯水，流速为1-5ml/min，收集各峰，检测各峰组分的抗肿瘤活性，将具有较好抗肿瘤活性峰的组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N16多肽。 

进一步，所述的抗肿瘤活性的检测方法为以肝癌细胞BEL-7402为靶细胞，采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分。