[发明专利]一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法。

背景技术

灭活抗原单独免疫动物时，不足于产生免疫原性，特别是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同种类的佐剂来增强抗原所诱导的免疫应答。国内外兽用疫苗生产商推广应用的油佐剂疫苗含有大量的矿物质油，在为养禽业保驾护航的同时也带来了不少的食品安全问题，例如，肉鸡胴体的疫苗残留问题已经引起越来越多人的担忧。

油包水（W/O）型油佐剂疫苗是由抗原液、稳定剂及矿物质油混合后，在高剪切力作用下制备而成。其免疫机理是在接种部位贮存一段时间，局部产生肉芽肿和炎症反应，吸引巨噬细胞、淋巴细胞等聚集以识别抗原，产生抗体。同时，缓慢扩散的油佐剂使抗原输送到二级淋巴器官的时间延长，不断刺激机体的免疫系统，从而产生续期长、抗体水平高的免疫效力。虽然国内外疫苗生产厂家的生产工艺不断改进，用油质量也不断提高，但由于这种制剂的连续油相在注射部位有驻留的倾向，在不少的情形中，这种W/O型油佐剂疫苗在接种部位附近产生大量无菌脓肿和肉芽肿，保护性抗体产生速度慢、易对动物胴体品质造成不良影响，并且在接种期间可能引起剧烈的疼痛。

水包油（O/W）型佐剂疫苗具有注射部位显现局部反应小且稳定性高的优势，然而包含或者暴露在连续相中的抗原很快在注射部位分散和被体液酶分解，难以提供长期的保护性抗体，常常需要特殊的免疫刺激剂和多次加强免疫，制备成本高，不被广泛使用。

因此运用复合微球制备概念，研究有效的可用于畜禽，且能解决上述问题的佐剂疫苗是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水包油包水型佐剂疫苗。本发明的佐剂疫苗可以减少现有灭活油苗的用油量，加快被免疫动物相应抗体的产生速度，减少疫苗制备成本。

本发明另一目的在于提供上述水包油包水型佐剂疫苗的制备方法。本发明制备的成品苗稳定性高。本发明方法操作步骤经过反复试验，各组成成分的量变及操作步骤顺序的改变均会影响复乳的包被效果、成品苗的粘度、稳定性、免疫效果及注射后吸收情况等。

本发明所采用的技术方案是：

一种水包油包水型佐剂疫苗，其由内部水相、用于包覆内部水相的中间油相以及用于包覆中间油相的外部水相组成；外部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：复合表面活性剂0.5～1.5%、亲水性表面活性剂0.3～0.6%、生理盐水9～18%；中间油相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：亲油性表面活性剂2～4%、稳定剂5～10 g/L、矿物质油30～50%；内部水相中的各组分，按水包油包水型佐剂疫苗原料的总体积计，包括：免疫增强剂溶液1.5～2.5%、亲水性表面活性剂0.5～1.5%，余量为灭活抗原液；所述百分比为体积百分比。

优选的，复合表面活性剂含有如下体积百分比的组分：40～60% Span-80、10～20%丙二醇，余量为油酸。

优选的，复合表面活性剂的HLB值为9～15。

优选的，外部水相和内部水相中的亲水性表面活性剂独立选自Tween-20、Tween-60、Tween-80中的至少一种。

优选的，亲油性表面活性剂为Span-20、Span-60、Span-80中的至少一种。

优选的，矿物质油为白油。

优选的，稳定剂为硬酯酸铝。

优选的，免疫增强剂溶液为黄芪多糖注射液或黄芪多糖粉水溶液。优选的，黄芪多糖注射液或黄芪多糖粉水溶液的浓度为0.1～0.15g/mL。

优选的，灭活抗原液中的抗原为传染性法氏囊病毒、腺病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、禽多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌中的至少一种。

上述的水包油包水型佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）将灭活抗原液、内部水相组分中的亲水性表面活性剂充分混合，然后加入免疫增强剂溶液，混匀，得内部水相； 

3）将稳定剂溶解于矿物质油中，然后加入中间油相组分中的亲油性表面活性剂，混匀，得中间油相；

4）将内部水相加入到中间油相中， 15000～20000rpm的剪切速度下乳化，得稳定的内球初乳；优选的，乳化时间为2～5min；

5）将生理盐水和外部水相组分中的亲水性表面活性剂充分混合，然后加入复合表面活性剂，混匀，得外部水相；

6）将内球初乳加入到外部水相中，800～1300rpm的剪切速度下乳化，得水包油包水型佐剂疫苗。优选的，乳化时间为4～6min。