[发明专利]峨眉拟单性木兰组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于农林苗木组织培养技术领域，具体是一种峨眉拟单性木兰组织培养方法。

背景技术

峨眉拟单性木兰为木兰科拟单性木兰属下的一个种，四川峨眉山特有常绿植物。因林木砍伐，植被破坏，在原产地所存植株极少，急待采取严格的保护措施。峨眉拟单性木兰其主要分布于常绿阔叶林中，其聚合果呈倒卵圆形，长3~4厘米，种子倒卵圆形，径6~8毫米，外种皮红褐色，易吸引鸟类觅食；因此很难得到可繁殖的种子。寻找一种安全的繁殖方法，挽救峨眉拟单性木兰这一濒危植物已迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种峨眉拟单性木兰组织培养的方法。通过峨眉拟单性木兰的茎尖作为外植体进行组培，实现峨眉拟单性木兰的人工繁殖。

本发明一种峨眉拟单性木兰组织培养的方法，包括下列步骤：。

1）外植体处理：取峨眉拟单性木兰嫩枝，清洗后，在无菌条件下，用质量浓度70%的酒精消毒30s，质量浓度0.01% 的HgCl2 溶液灭毒10-15 min，用无菌水冲洗5-6 次。

2）诱导培养：将经灭毒的嫩枝，取1cm长茎尖作外植体，接种于诱导培养基，培养温度27±2°C，光照12h，光照强度2000Lx，培养40-45天即可长成3 cm 左右的嫩梢。所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.02 mg/L， KT 1.5 mg/L，蔗糖3%，琼脂0.5%，pH 5.8。

3）分化培养：从诱导培养基上剪切已萌动的嫩梢，转入分化培养基，培养温度27±2°C，光照12h，光照强度2000Lx，20天每个接种的嫩梢可分化出大于0.5 cm的有效不定芽达4个左右。培养时间为45天。所述分化培养基以MS为基础培养基，添加6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.02 mg/L，蔗糖3%，琼脂0.5%，pH 5.8。

4）生根培养：从分化培养基上剪下长高至3-4 cm的试管苗嫩梢，转入生根培养基，培养温度27±2°C，光照12h，光照强度2000Lx，培养时间为20天，生根率达80%以上。所述生根培养基以1/2MS为基础培养基，添加NAA 0.5 mg/L，IBA 2.5 mg/L，蔗糖1.5%，琼脂0.5%，pH 5.8。

5）炼苗培养：将组培苗瓶移至室外，自然光下封口炼苗10-15天，取出组培苗将根部的琼脂洗净，移栽到经过0.2% 的高锰酸钾消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于23-30°C的温室中生长。半个月后将苗栽于营养钵中，于遮光50%的阴棚下放置30天，即可进行常规管理。

本发明是利用植物细胞全能性的生物技术，合理采取峨眉拟单性木兰嫩枝茎尖作为外植体，在配合比合理的培养基中培养，可在短期内繁殖出大量的峨眉拟单性木兰组培苗。本发明优点在于提供了一条全新的峨眉拟单性木兰组培方法，建立无菌培养体系，提供适宜的温度、光照，培育成新个体。

具体实施方式

取峨眉拟单性木兰嫩枝用0. 1%洗衣粉水浸洗30min后，用自来水冲洗1h备用。

无菌条件下，峨眉拟单性木兰嫩枝用70%的酒精消毒30s后，0. 1% HgCl₂处理10-15 min，无菌水冲洗5-6次，取lcm长的普通茎尖做外植体，接种诱导培养基。

诱导培养基以MS为基础培养基，添加6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.02 mg/L， KT 1.5 mg/L，蔗糖3%，琼脂0.5%，pH 5.8，培养温度27±2°C，光照12h，光照强度2000Lx，培养40-45天即可长成3 cm 左右的嫩梢，剪切已萌动的嫩梢，转入分化培养基。

分化培养基以MS为基础培养基，添加6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.02 mg/L，蔗糖3%，琼脂0.5%，pH 5.8，培养温度27±2°C，光照12h，光照强度2000Lx，20天每个接种的嫩梢可分化出大于0.5 cm的有效不定芽达4个左右。培养时间为45天，剪下长高至3-4 cm的试管苗嫩梢，转入生根培养基。

生根培养基以1/2MS为基础培养基，添加NAA 0.5 mg/L，IBA 2.5 mg/L，蔗糖1.5%，琼脂0.5%，pH 5.8，培养温度27±2°C，光照12h，光照强度2000Lx，培养时间为20天，生根率达80%以上。

将组培苗瓶移至室外，自然光下封口炼苗10-15天，取出组培苗将根部的琼脂洗净，移栽到经过0.2% 的高锰酸钾消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于23-30°C的温室中生长。半个月后将苗栽于营养钵中，于遮光50%的阴棚下放置30天，即可进行常规管理。