[发明专利]体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建方法

权利要求书

1.一种人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基因；所述大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。

2.根据权利要求1所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包含插入到人线粒体DNA的D-LOOP区、并连接在大肠杆菌复制子基因的C端的抗性筛选基因。

3.根据权利要求2所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为SalⅠ位点、BglⅡ位点和NotⅠ位点的至少两个。

4.根据权利要求2所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含AleⅠ位点。

5.根据权利要求2或3所述的人线粒体DNA重组质粒，其特征在于，所述抗性筛选基因为氨苄基因。

6.一种人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A、提取完整的人线粒体DNA；

B、从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及

C、同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得所述人线粒体DNA重组质粒。

7.根据权利要求6所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤B包括：

设计一对引物：

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物4：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC CAA AAG GCC AGC AAA AGG CCA-3’；

基于PCR方法，使用引物3和引物4从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因。

8.根据权利要求7所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，扩增出的所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含AleⅠ位点；扩增出的所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为SalⅠ位点、BglⅡ位点和NotⅠ位点的至少两个。

9.根据权利要求6所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤B包括：

设计一对引物：

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物5：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC AGA TCA AAG GAT CTT CTT GAG-3’；

基于PCR方法，使用引物3和引物5从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因。

10.根据权利要求6所述的人线粒体DNA重组质粒的构建方法，其特征在于，在所述步骤C中，使用限制性内切酶AleⅠ同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后用T4连接酶连接在一起。