[发明专利]体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，并涉及真核生物的DNA在原核生物中的表达。更具体地，本发明涉及一种体外复制的人线粒体DNA质粒及其构建方法，该质粒可实现人线粒体DNA（mt-DNA）的完整复制。

背景技术

线粒体是一个对环境变化十分敏感的细胞器。在许多疾病状态下，线粒体的结构和功能都会发生相应的改变，并成为疾病病理变化的一部分。另一方面，线粒体的异常也可能成为疾病发生的原因，这种以线粒体结构或功能异常为主要病因的一大类疾病称为线粒体病。

线粒体病中线粒体DNA（mt-DNA）的缺失、变异以及重复是致病的重要原因。线粒体基因组是一个环状双DNA，核酸序列和组成比较保守。人类的线粒体基因组由16569bp组成，其外环为重（H）链，内环为轻（L）链；除一段非编码区（D-loop区）外均为编码区，共编码l3个多肽、22个tRNA和2个rRNA。D-loop区是一大小约为1000bp的调控区，其包含有重链复制起始点、保守序列节段、轻链启动子、重链启动子及终止结合序列等，几乎所有与mt-DNA复制、转录和翻译相关的调控序列都位于该区。D-loop区为非编码区，插入该区的外源基因不会对mt-DNA复制、转录和翻译相关的调控序列以及编码功能造成影响，也即不会影响到mt-DNA基因的功能。

通常情况下，基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。这就需要两方面的技术要求，一种是针对疾病制备某种外源基因（外源DNA），其二则需要将这种外源DNA导入靶细胞中，替换异常DNA。随着基因治疗手段的发展，采用该方法治疗由于DNA缺失、变异或重复等导致的线粒体病也成为本领域的研究热点。但由于人线粒体DNA是典型的真核基因，现有技术中其功能性研究仍停留在真核水平，研究复杂程度较高，不利于实现简化的试验操作方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中人线粒体的功能性研究仍停留在真核水平而导致的研究复杂程度高的缺陷，提供人线粒体DNA重组质粒及其构建方法，通过该方法实现人线粒体DNA在原核生物内的体外复制，降低研究复杂度。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种人线粒体DNA重组质粒，所述重组质粒包含完整的人线粒体DNA和大肠杆菌复制子基因；所述大肠杆菌复制子基因插入人线粒体DNA的D-LOOP区。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述重组质粒还包含插入到人线粒体DNA的D-LOOP区、并连接在大肠杆菌复制子基因的C端的抗性筛选基因。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为SalⅠ位点、BglⅡ位点和NotⅠ位点的至少两个。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含AleⅠ位点。

在上述人线粒体DNA重组质粒中，所述抗性筛选基因为氨苄基因。

根据本发明的另一方面，提供一种人线粒体DNA重组质粒的构建方法，该方法包括以下步骤：

A、提取完整的人线粒体DNA；

B、从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因、或扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因，作为插入人线粒体DNA中的外源基因；以及

C、同时酶切人线粒体DNA和外源基因，将酶切过的人线粒体DNA和外源基因经去磷酸化处理后连接在一起，制得所述人线粒体DNA重组质粒。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，所述步骤B包括：

设计一对引物：

引物3：5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；

引物4：5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT-3’；

基于PCR方法，使用引物1和引物2从pUC19质粒中扩增出大肠杆菌复制子基因和抗性筛选基因。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，扩增出的所述大肠杆菌复制子基因的N端和所述抗性筛选基因的C端均包含AleⅠ位点；扩增出的所述抗性筛选基因具有多克隆位点，所述多克隆位点为SalⅠ位点、BglⅡ位点和NotⅠ位点的至少两个。

在上述人线粒体DNA重组质粒的构建方法中，所述步骤B包括：

设计一对引物：