[发明专利]糖化血红蛋白的纯化工艺

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫技术领域，具体涉及糖化血红蛋白的纯化工艺。

背景技术

糖化血红蛋白(glycosylated hemoglohin，GHb)是血液中红细胞内血红蛋白(hemoglobin，Hh)与碳水化合物通过非酶促作用形成的化合物。人类Hh主要是HbA(95～97%)、HbA2(＜3%)、HbF(＜l%)。HbA与糖结合部分为HbAl，未结合糖部分为HbAO。根据所结合的碳水化合物不同，GHb分为HbAlal、HbAla2、HbAlb、HbAlc，其中HbAlc约占HbAl的80%，是Hh的一条或两条β链氨基末端与葡萄糖羰基形成的稳定加成化合物。HbAlc的含量与血糖浓度呈明显正相关，能直接反应血糖升高患者过去2～3个月血糖控制的平均水平，它不受偶尔一次血糖升高或降低的影响，因此对糖化血红蛋白进行测定，可以比较全面地了解过去一段时间的血糖控制水平，现已成为糖尿病监测的“金标准”。

现有关于HbAlc的报道多为HbAlc的检测分析方法，少量关于分离HbAlc的方法均采用微柱法，其中用的均是Bio-Rex 70阳离子交换树脂，通过改变缓冲液的pH值或盐浓度来分离纯化HbAlc蛋白。目前还未发现有用CM-Sepharose Fast F1ow层析柱来分离HbAlc的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的糖化血红蛋白的纯化工艺。该工艺通过CM-Sepharose Fast F1ow柱层析以获得高纯度的HbAlc抗原。

本发明所述的糖化血红蛋白的纯化工艺，是取血红蛋白液，上CM-Sepharose Fast F1ow层析柱，经流动相梯度洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，收集HbAlc含量≥99%的部分，从而获得高纯度HbAlc抗原；其中，所述的流动相由A液和B液组成，所述A液和B液的组成如下：

A液：15～25mmol/L NaAc，pH=5.6～5.8；或者是15～25mmol/L NaAc+0.0l～0.05%NaN₃，pH=5.6～5.8(NaN₃的加入可以防止蛋白的降解)；

B液：15～25mmol/L NaAc+280～320mmol/L NaCl+0.0l～0.05%NaN₃，pH=5.6～5.8。

上述纯化工艺中，流动相中A液和B液的组成优选如下：

A液：20mmol/L NaAc，pH=5.7；

B液：20mmol/L NaAc+300mmol/L NaCl+0.03%NaN₃，pH=5.7。

更为优选的A液和B液的组成如下：

A液：20mmol/L NaAc+0.03%NaN₃，pH=5.7；

B液：20mmol/L NaAc+300mmol/L NaCl+0.03%NaN₃，pH=5.7。

上述纯化工艺，洗脱峰中HbAlc含量的检测可以采用现有技术中常规的检测方法，优选采用高效液相色谱法，具体地，可以用Bio-Rex 70阳离子交换树脂HPLC(高效液相色谱)法检测HbAlc的含量，或者是用与Bio-Rex 70阳离子交换树脂性质相似的SOURCE 15S 4.6/100PE离子交换树脂(Amersham Pharmacia Biotech Inc)HPLC法来检测HbAlc的含量。SOURCE 15S 4.6/100PE是Tricorn高效层析柱，用于快速分离。

上述技术方案中，血红蛋白液上CM-Sepharose Fast F1ow层析柱时，流动相的洗脱条件为：

1)在0.5倍柱体积洗脱液的时间内：A液：100%→70%～90；

2)在l倍柱体积洗脱液的时间内：A液：70～90%，B液：30～10%；

3)在1倍柱体积洗脱液的时间内：A液：60～70%，B液：40～30%；

4)在1倍柱体积洗脱液的时间内：A液：60～70%→40～30%，B液：40～30%→60～70%：

5)在2倍柱体积洗脱液的时间内：A液：30～40%。

优选的流动相的洗脱条件为：

1)在0.5倍柱体积洗脱液的时间内：A液：100%→80%；

2)在l倍柱体积洗脱液的时间内：A液：75～85%，B液：25～15%；

3)在l倍柱体积洗脱液的时间内：A液：60～65%，B液：40～35%；