[发明专利]蔗糖酶-DNA复合物及其制备方法、相关试剂盒及配合血糖仪检测HBV不同分型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶与DNA结合的复合物及其制备和在病毒检测中的应用，尤其涉及一种蔗糖酶-DNA复合物及其制备方法，及该复合物制成的试剂盒和在乙型肝炎病毒不同基因分型检测中的具体应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的感染性疾病，全世界有3.5亿乙型肝炎病毒携带者，乙肝不仅损害人体健康，而且给家庭、社会造成沉重的经济负担。乙型肝炎病毒(HBV)是目前已知的最小DNA病毒，部分双链的环形基因组，全长3.2Kb。HBV有8种基因分型，不同的基因分型之间存在致病性和抗药性的差异。由于中国地区95％以上的乙型肝炎病毒携带者均可归为B、C、D三种HBV病毒株，因此B、C、D三种HBV病毒株的基因分型成为我们主要的研究对象。目前，国内外传统的临床诊断方法无法有效地检测乙型肝炎病毒的基因分型，在临床上会表现为漏诊、盲目用药和延误治疗。因此，发展快速、准确、简单易行的HBV基因分型检测技术，在乙肝诊断、治疗以及研究HBV基因组变异等方面有着非常重要的现实意义。

开发一种便携式传感器，以用于快速、低成本且能够在住所或事发地实时定量地检测目标物(例如离子、小分子、DNA、蛋白质等)，这是人们长期以来的研发目标。近年来，便携式检测仪器的研究取得了重大进展，血糖仪等便携式检测仪器已经商业化，基本满足了大众对于某些疾病的家用诊断和预防等方面的需求，也改善了数以万计疾病患者的生活状况。然而，现有的便携式检测仪器往往只可检测单目标物。近几年，一些研究者发展了将便携式血糖仪与功能化的DNA传感器结合起来以用于检测分析血糖以外其他目标物的检测新方法，例如Lu等(Yu Xiang，Yi Lu.Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.Nature Chemistry，2011，3(9)∶697-703.)、Yuan等(Jiao Su，Jin Xu.Ying Chen.et al.Personal glucose sensor for point-of-care early cancer diagnosis.Chem.Commun.2012，48，6909-6911)利用血糖仪分别实现了单个小分子、蛋白以及DNA的检测，然而目前暂未出现利用便携式血糖仪检测乙型肝炎病毒基因分型的检测技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物及其制备方法，还相应提供一种该复合物制成的低成本、易操作、不需外援设备、使用携带方便、检测结果准确的试剂盒，以及用该试剂盒配合血糖仪(体外)检测乙型肝炎病毒不同分型的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物，所述蔗糖酶-DNA复合物为链式分子结构，所述蔗糖酶-DNA复合物的分子一端为蔗糖酶，所述蔗糖酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于乙型肝炎病毒不同基因型上的辅助探针，所述蔗糖酶上含有氨基，所述辅助探针上修饰有巯基；所述蔗糖酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团；所述辅助探针的核苷酸序列为：5’-SH-(T)₁₀ATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTG-3’。

上述的技术方案中，所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环1号位上一般通过羰基与所述蔗糖酶上的氨基相连，所述辅助探针通过其上修饰的巯基连接至所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。

上述本发明的技术方案还提出了一种可用于血糖仪检测乙型肝炎病毒不同分型的蔗糖酶-DNA复合物，其复合物合成时利用的基本原理为(可参见图1)：以4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)做为生成连接臂的原料，进而将巯基化的辅助探针与蔗糖酶连接起来，本领域技术人员一般很预见到这二者的结合方式及结合后的具体应用效果，而本发明中由于是针对特定领域的具体应用，因此创造性地将该蔗糖酶与该特定核苷酸序列的辅助探针进行了有效结合。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的蔗糖酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤：