[发明专利]一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用。

技术背景

低聚木糖亦称木寡糖（xylooligosaccharides），是由2～10个D-木糖以β-1,4-木糖苷键结合而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中的一个重要成员。低聚木糖有明显的双歧杆菌增殖作用，而且除青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌外，大多数肠道菌对低聚木糖的利用都比较差，能抑制肠道有害菌的生长发育；低聚木糖不被消化，与其他的低聚糖相比，木二糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，可满足患有诸如糖尿病、肥胖病和高血脂症等特殊人群的需要；低聚木糖有抗龋齿，有利于口腔健康；低聚木糖促进人体对钙的吸收，防止老化和骨质疏松症。低聚木糖已经广泛应用于医药保健品、乳品饮料、食品和饲料等。

低聚木糖的生产通常是采用物理、化学及酶解等方法水解富含木聚糖的原料，然后对产物进行提取精制。制备低聚木糖的原料是木聚糖，它在玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕麦、桦木等农林产品中含量相对较高，平均可达30%左右。目前生产低聚木糖的主要方法是酶法水解木聚糖。利用内切木聚糖酶水解木聚糖底物得到的以木二糖、木三糖为主要成分的混合物。而酶解法的关键在于木聚糖酶对应底物的适应性，即选择合适的木聚糖酶。

很多微生物如细菌、霉菌和放线菌等均能产生木聚糖酶。木聚糖酶来源不同，结构和性质也不尽相同，其酶解木聚糖后释放出的寡糖链长也不相同。而木二糖、木三糖和木四糖是低聚木糖中功效较好的组分，因此这几种组分在酶解产物中含量越高越好。目前人们研究和应用最多的是细菌和霉菌来源的木聚糖酶，其酶解木聚糖的产物中木二糖～木四糖的含量比较低，而木糖及其他链长度组分含量较高。因此，现在急需开发出性能更好、专一性更强的木聚糖酶，更广泛的应用于低聚木糖的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程技术手段，将斜卧青霉（Penicillium decumbens）的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性条件下具有较高的活性。该酶对底物的专一性强，利用其酶解作用生产的低聚木糖中二糖、三糖和四糖的含量高，适用于高效生产低聚木糖。

申请人经过大量的筛选后，发现将克隆自斜卧青霉的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，毕赤酵母表达的木聚糖酶对底物的专一性很强，从而促成本发明。

一方面，本发明提供了一种克隆自斜卧青霉的木聚糖酶，该木聚糖酶的最适pH值为5.0，在pH4.0-7.0的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为60℃，在温度40-70℃的范围内，能保持50%以上的活性。

本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶，其具有

1）SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或者

2）在SEQ ID NO:1中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的木聚糖酶活性的氨基酸序列。

本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因为

1）核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

2）在严格条件下与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的DNA分子。

在本发明的一个优选实施方案中，上述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因具有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。

本发明所述木聚糖酶能针对性的酶解木聚糖。酶解产物中低聚木二糖～低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖～低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。

因此，本发明另一方面提供了上述木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。

另一方面，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该工程菌携带有能表达所述斜卧青霉木聚糖酶基因的表达载体。

在本发明的一个实施方案中，所述的表达载体为pPIC9K，筛选标记为遗传霉素。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母菌株GS115。

另一方面，本发明提供了上述毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的用途。

另一方面，本发明还提供了用于克隆木聚糖酶编码基因的引物对，其核苷酸序列为

引物F：5’-GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3’（SEQ ID NO:3）