[发明专利]一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测仙台病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBR G reen I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对小鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行仙台病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

仙台病毒(Sendai virus，SeV)属副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒，呈多形性，主要为球形，直径约200μm。SeV是一种单股负链RNA病毒，基因组大小为15kb。SeV是引起啮齿类动物呼吸系统疾病的主要病原，可影响幼鼠发育成长和降低成年鼠的繁殖率，且很难从鼠群中清除。SeV甚至可感染灵长类动物及人类，它主要引起婴幼儿下呼吸道严重疾病及较大儿童的上呼吸道感染，以发热、咳嗽、气喘或胸闷胸痛为主，甚至造成致死性感染。但对较大儿童和成人一般只引起普通感冒症状的上呼吸道感染，很少导致感染死亡。SeV广泛分布于世界各地，其流行或散发常与流感病毒伴发流行。因此《中华人民共和国药典》规定对鼠源性生物制品必须检测仙台病毒。诊断实验小鼠的仙台病毒感染和控制其蔓延都具有积极意义。目前的检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：

1、血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。

2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。

3、分子生物学诊断技术，即应用普通RT-PCR技术检测仙台病毒(Yukiharu H,Kiyoka ke T,Michisato K,et al.Detection of nucleoprotein gene of Sendai virus in the lungs of rats by touchdown nested reverse transcription polymerase chain reaction[J].Experimental Animals,1997,46(4),307-310)。普通RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度较高，解决了血清学方法无法对无血清生物制品和免疫缺陷小鼠进行检测的缺点。但是由于普通RT-PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以该方法无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR)技术具有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。在基因表达水平分析(Nellemann C,Vinggaard AM,Dalagaard M,et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by Light Cycler Tec hnology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原体的定性(Bhudevi B,Weinstock D.Fluoro genic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea V irus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang,Jun Wang,Donald V.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assa y[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;Birgit Liss.Improved quantitative real-time R T-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res.,2002,Vol.30N o.17e89.Florence KP,Glaucia PB,Mireille S,et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBR Green I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。本发明所采用的基于SYBR Green I荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便，且具有良好的重复性和灵敏度。