[发明专利]一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测小鼠痘病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对小鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行小鼠痘病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

小鼠痘病毒(Ectromelia virus，ECTV)属痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chor dopoxvirinae)正痘病毒属(Orthpoxvirus)，是一种单一分子双链DNA病毒，病毒粒子为砖形，大小为200nm×200nm×250nm，对乙醚抗性。其基因组序列与天花病毒有很大的相似性，因此《中华人民共和国药典》规定对鼠源性生物制品必须检测小鼠痘病毒。小鼠痘病毒感染有急性和慢性两种形式，常见实验室烈性传染性脱脚病就是由小鼠痘病毒急性感染引起，临床表现为四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征。慢性感染中主要为持续性感染，小鼠痘病毒慢性持续性感染小鼠没有明显临床症状，是诱发脱脚病或产生病毒传染的主要因素。因此，对实验小鼠慢性持续性小鼠痘病毒感染诊断，对控制小鼠痘病毒蔓延、防止脱脚病发生具有积极意义。目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：

1、血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。

2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。

3、分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测小鼠痘病毒持续感染。PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。在上世纪90年代，国内就有报道使用PCR技术建立检测小鼠痘病毒的方法，最低检出小鼠痘病毒DNA量为0.1pg。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以该方法无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR)技术有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。在基因表达水平分析(Nellema nn C,Vinggaard AM,Dalagaard M,et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determin ed by Light Cycler Technology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原体的定性(Bhudevi B,Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tan g,Jun Wang,Donald V.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-P CR with a TaqMan assay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;Birgit Liss.Improve d quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Ac ids Res.,2002,Vol.30No.17e89.Florence KP,Glaucia PB,Mireille S,et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBR Green I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。M.SofiIbrahim等(2003)使用基于TaqMan探针的real-time PCR法检测天花病毒，最低检测浓度能达到1fg/μL(25copies)，比普通PCR方法灵敏100倍。Luo A-dong等(2008)使用SYBR Green I荧光染料建立山羊痘病毒荧光定量PCR检测方法，最低能检测700copies DNA样品。SYBR Green I荧光染料法和TaqMan探针法在灵敏度上相差不大。目前，国内已有基于TaqMan探针技术的real-time PCR检测小鼠痘病毒的专利方法，“用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法（申请公布号CN102329889A）”。本发明所采用的基于SYBR Green I荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便。