[发明专利]一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4及其构建方法无效

专利信息
申请号: 201310132610.2 申请日: 2013-04-16
公开(公告)号: CN103233033A 公开(公告)日: 2013-08-07
发明(设计)人: 孙梅好;徐丽珊;马建辉;邱洋松;孙婧;孙爱;邬丹妮;张冰倩 申请(专利权)人: 浙江师范大学
主分类号: C12N15/70 分类号: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
代理公司: 杭州丰禾专利事务所有限公司 33214 代理人: 王从友
地址: 321004 *** 国省代码: 浙江;33
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 有效 生物 检测 细胞株 gpsegfp4 及其 构建 方法
【权利要求书】:

1.一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4的构建方法,其特征在于该细胞株的构建方法包括以下的步骤:

一、pSECIS1载体的构建

1.1)pK6Xho I载体构建

定点突变pK6载体得到XhoI酶切位点,纯化产物并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经测序验证得pK6XhoI载体;

1.2)pK6Xho I-CAT载体构建

氯霉素抗性基因进行PCR扩增,PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳,并割胶回收、纯化目的条带,用SmaI酶切pK6XhoI载体,纯化后与氯霉素抗性基因连接,经菌液PCR与测序验证得到pK6Xho I-CAT载体;

1.3)pSECIS1载体构建

通过两次聚合酶链式反应扩增得到SECIS序列,模板依次为pK6Xho I-CAT载体、第一次PCR产物纯化产物,将第二次PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测并纯化,用Xho I和Hind III分别酶切pCAT载体和SECIS 序列,纯化酶切产物并连接,经菌液PCR和测序验证得到pSECIS1载体;

1.4)pSECIS突变载体构建

对pSECIS1质粒进行定点突变,将纯化产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经测序验证得到13个正确的突变体;

二、pCOLA-SelABC载体构建

2.1)pCOLA-SelC载体构建

PCR扩增SelC基因序列,纯化PCR产物并与pMD18T simple载体连接,测序验证得到pMD18T simple-SelC,用Nde I、Kpn I分别酶切PCOLAduet-1载体、sSelC质粒,琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收纯化、连接并转入DH5α感受态细胞,菌液PCR与测序验证得到pCOLA-SelC载体;

2.2)pCOLA-SelABC载体构建

扩增SelAB基因序列,PCR产物纯化、与pMD18T simple载体连接、转化到DH5α感受态细胞并测序验证得到pMD-18T simple-SelAB,BamH I 和Hind III双酶切 pCOLA-SelC质粒与sSelAB基因序列,酶切产物电泳并割胶回收纯化、连接并转化入BL21感受态细胞,菌液PCR与测序验证得到pCOLA-SelABC载体;

三、pSECIS突变体筛选

3.1)测定13种pSEICIS突变体及野生型的生长曲线

从Chl平板上挑取突变的13种pSECIS及野生型菌种的单菌落,LB培养基培养过夜,用含氨苄青霉素和硒酸钠的LB培养基稀释菌液至OD600=0.05,37℃,振荡培养,测定1、2、3、4、5、6、7 h七个时间点的菌液OD600

记录分析在含硒和不含硒液体LB培养基中的生长繁殖速度;在不含硒的氨苄LB培养基中,只有不编码硒蛋白的野生型pSECIS14正常生长,其他的生长均非常缓慢且无明显区别;在0.5 mM硒酸盐存在的情况下,野生型pSECIS14生长速度与不加硒的生长类似,而pSECIS4的生长速度明显提高,基本是阳性对照野生型pSECIS14生长速度的一半左右,快于pSECIS1以及另外的SECIS突变;筛选获得pSECIS4突变体;

四、pET23a-SECIS-GFP载体构建

4.1) pET23a-SECIS-GFP载体构建

三次PCR扩增SEGFP序列在GFP 5’端引入UGA/SECIS序列,模板依次为GFP基因、第一次PCR产物、第二次PCR产物;纯化PCR产物,第三次PCR产物末端加A,后纯化并与pMD18T simple载体连接,转化进入大肠杆菌DH5α,筛选并测序验证,得到pMD18T simple-SECIS-GFP载体;Nde I和Hind Ⅲ 分别酶切sSEGFP和pET23a并连接、转化,得到pSEGFP质粒并菌液PCR验证;

4.2) pET23a-SECIS4-GFP突变体构建

pET23a-SECIS-GFP质粒载体突变,将PCR产物纯化后转化进入DH5α感受态细胞并测序验证;提取pSEGFP4质粒并与pSelABC质粒共转化进入BL21感受态细胞获得GpSEGFP4。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于浙江师范大学,未经浙江师范大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201310132610.2/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top