[发明专利]一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有效硒生物检测用细胞株及其构建方法。

背景技术

硒是许多真核生物、细菌和古菌的必需微量元素，主要以第21种氨基酸硒代半胱氨酸（Selenocysteine，Sec）的形式进入硒蛋白发挥功能，与人类健康关系密切。研究结果表明硒缺乏易造成心血管疾病、免疫力低下、男性不育、增加各种癌症的患病几率等；而过多摄入硒可引起动物的各种急性和慢性硒中毒。硒在地壳中分布广泛但不均匀，中国约有三分之二的地区为缺硒区；而某些个别地区含量非常高，甚至达到了对人畜有中毒危险的水平。生物体主要从环境中获取硒元素并部分转化为在体内发挥功能的有效硒，体内有效硒含量直接或间接影响动植物的健康生长，因此检测环境及生物制品中有效硒的含量对维系生物安全具有重要的意义。

硒的化学性质与硫非常类似，经硫转运蛋白吸收的硒酸盐，在细菌胞内经ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase，ATPS）活化为腺苷-5’-磷硒酸（Adenosine 5’-PhosphoSelenate，APSe），可进一步还原形成亚硒酸和Se^2-。胞内的Se^2-在硒磷酸合成酶（SelD）的催化下活化为硒磷酸；丝氨酰tRNA合成酶可催化tRNA_UCA^sec（SelC转录产物）和丝氨酸活化为Ser-tRNA_UCA^sec。在硒代半胱氨酸合酶（SelA）的催化下利用Ser-tRNA_UCA^sec和硒磷酸合成Sec-tRNA_UCA^sec。Sec-tRNA_UCA^sec能被特殊的延伸因子SelB识别结合，与GTP、硒代半胱氨酸插入识别序列（Selenocysteine insertion sequence，SECIS，图1）形成SelB四元复合物，通过与核糖体mRNA相互作用，将Sec密码子UGA解读为Sec。原核生物中硒蛋白的表达，必需具以下几个条件：1）mRNA具硒代半胱氨酸的密码子UGA；2）UGA正下游的茎环结构SECIS（顺式作用元件）；3）4种独特的基因产物SelA、SelB、SelC、SelD（反式作用元件）。这些条件的满足并不能保证UGA/SECIS一定会编码Sec，UGA能否通读翻译形成硒蛋白由多种因素调控，如：硒源的充足与否；SelB四元复合物形成的过程和组分的比例；RF2和Sec-tRNA_UCA^sec的相对浓度和UGA通读的准确性等。

鉴于硒剂量的重要性，各地区环境及生物样品中硒含量的检测备受关注。目前常见的硒含量测定方法主要为物理化学方法。其他测定方法包括分析含硒酶的活性等，如测定哺乳动物体内硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶活性可间接测定硒的营养状态。而上述方式只能检测样品内总硒含量，无法检测出能被生物利用的有效硒，更无法检测出生物对何种状态的硒元素有更高的利用率。硒酸盐为常见的生物有效硒的一种。根据原核生物硒代半胱氨酸的插入机制，在硒酸盐为限制因子的条件下，硒酸盐可有效转化为Sec，且在充足的硒蛋白mRNA及SelB的情况下，培养基中的硒含量可能与胞内硒蛋白（报告基因）的合成量有一定的正相关性，此为构建有效硒生物检测器的理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4的构建方法，该方法通过UGA/SECIS控制荧光蛋白GFP表达，在外界条件优化的前提下，培养基中硒酸盐的含量即为被大肠杆菌所利用的生物有效硒，通过分析硒含量和荧光蛋白的荧光强度之间的关系，从而定量硒，构建有效硒的检测器。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4的构建方法，该细胞株的构建方法包括以下的步骤：

一、pSECIS1载体的构建

1.1）pK6Xho I载体构建

定点突变pK6载体得到XhoI酶切位点，纯化产物并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经测序验证得pK6XhoI载体；

1.2）pK6Xho I-CAT载体构建