[发明专利]多倍体积雪草品种及其培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种四倍体﹑三倍体积雪草品种及其培育方法。

背景技术

伞形科植物积雪草Centela asiatica(L．)Urban别名雷公根、崩大碗等，为二倍体植株，主产于广西、贵州、云南、广东等地，为历年版《中国药典》所收载的常用中药，全草入药。其味苦、辛，性凉，具有清热利湿、解毒消肿的功效。是生产三金片、玉叶解毒糖浆等中成药的核心原料，中医临床用于治疗湿热黄疸，中暑腹泻，石淋血淋，痈肿疮毒，跌扑损伤等疾病。民间常作为凉茶、蔬菜食用。近年来，诸多企业用于提取积雪草甙、积雪草酸等，市场需求不断增加。长期以来，积雪草品种培育、种苗繁育、人工种植仍处于空白，目前仅依靠野生资源。但野生积雪草分布零散，植株小、产量低、大量采收难度大。即使开展人工种植，其投入大于产出，无人问津，导致积雪草原料供应紧张。

通过倍数性育种手段使药用植物基因组多倍化，可以获得株型大、有效成分含量高的品种、大幅提高药用植物的产量与品质，使人工种植成为现实。而且，三倍体药用植物在遗传空间上与其他品种形成生殖隔离，无后代分离，是永久杂种，可以固定杂种优势。

发明内容

为提高积雪草的产量和品质，本发明提供了多倍体积雪草品种及其培育方法。本发明是用氨磺灵作为诱导剂，通过液体法或固体法进行人工诱导，成功获得一种积雪草同源四倍体品种，然后可以与常规二倍体野生种杂交筛选培育出三倍体积雪草品种。

本发明提供的多倍体积雪草品种培育方包括以下步骤：

1）从二倍体积雪草种质资源中筛选出优良积雪草植株；

2）选取优良积雪草成年植株的顶芽，经预处理后按常规分化培养基诱导产生不定芽和愈伤组织，然后转接到常规增殖培养基进行继代培养；

3）将步骤2）中生长势强的组培继代苗或是分生能力强的愈伤组织暗培养5天后，以氨磺灵为诱变剂，采用液体或固体混培法，诱变积雪草组培继代苗或愈伤组织产生染色体基因组倍数性变化，转入常规分化培养基中进行光照培养，获得丛生芽，分株后转入生根培养基中培养成根茎叶完整的组培苗；

4）将步骤3）获得的根茎叶完整的组培苗与二倍体组培苗对照，将叶片大小、颜色有明显变化的植株选为基因组可能加倍的候选植株；

5）剪取步骤4）中的候选植株的分生组织，进行染色体倍性鉴定，选取染色体数目2n=4x=36的幼苗，将其炼苗、种植成活，即获得四倍体积雪草品种。

还可以继续包括以下步骤：

6）将四倍体积雪草和二倍体积雪草人工授粉杂交，得到杂交积雪草种子；

7）将杂交种子繁育成完整植株种植，再对其分生组织进行染色体数目检测，筛选获得三倍体积雪草品种。

下面列举以上主要步骤的优选操作方法：

步骤1）中，作为原始亲本的优良积雪草植株是指：从染色体核型指数为2n=18的野生积雪草中选择具有茎段节间长、茎粗、叶片大且厚实、有效成分含量高的成年植株。

步骤3）所述诱变方法是：固体混培法是指在无菌条件下将生长势强的组培继代苗或是分生能力强的愈伤组织暗培养5-7天，然后转接到添加有10-12μmol.L-1氨磺灵溶液MS固体培养基中在5-10℃低温下暗培养2-5d，再转入不含氨磺灵溶液常规分化培养基中进行光照培养；液体法是指在无菌条件下先用保水性好的材料覆盖住继代苗顶芽或愈伤组织，然后滴入过滤灭菌的8-10μmol.L-1氨磺灵溶液将棉花完全浸湿后在5-10℃低温下暗培养10-12小时，无菌水洗净，转入不含氨磺灵溶液的常规分化培养基中光照培养； 

步骤3）所述的光照培养是每天光照10小时，光照强度为1000-2000lx，培养温度为25℃；

步骤3）所述的生根培养是：培养基为1/2MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L，培养条件为暗培养7d后进行光照培养，光照强度为1000-2000lx，培养时间为10h∕d，培养温度是25℃。

步骤5）所述的染色体倍性鉴定方法是：剪取目标株幼嫩根尖0.5cm，清水浸泡，经过无水乙醇：冰乙酸=3：1的卡诺固定液固定15min以上，清水冲洗15min, 浓盐酸：甲醇=1：1的解离液解离2-30min，清水冲洗15min，切取根尖0.1mm，用卡宝品红染色液染色，压片观察统计根尖染色体。

步骤6）所述的三倍体杂交积雪草种子为：♀4N×♂2N或♂4N×♀2N→F1为3x。

本发明提供的多倍体积雪草品种即为上述方法培育而得的四倍体积雪草品种或者三倍体积雪草品种。

本发明的优点：