[发明专利]一种氢溴酸高乌甲素质量鉴定HPLC检测技术

说明书

  

技术领域：

    植物提取技术、质量检测技术。

背景技术： 

氢溴酸高乌甲素是从毛蓖科植物高乌头(Acenitum simon- tanum Nali)根中提取的总碱, 经化学分离获得的一种有效成分为二萜类单体生物碱刺乌头碱(Lappaconitine)的氢溴酸盐，药理及临床表明具有较强的镇痛及消肿、解热、局麻作用。其镇痛作用为氨基比林的七倍，对恶性肿瘤疼痛及其他顽固性疼痛的疗效尤为显著。用于病人自控镇痛效果优良率明显高于曲马多，且恶心、呕吐发生率减少。为国内首创的非依赖性镇痛药, 是卫生部 《癌症病人三阶梯止痛疗法指导原则》中规定的中度镇痛药。

氢溴酸高乌甲素原料药的质量控制国际上尚没有统一的标准，特别是在质量检测方法上。含量测定有采用分光光度法进行的，有采用非水滴定法进行的，有采用HPLC内标法进行的，这些方法检测结果都会出现较大的差异性。分光光度法、非水滴定法，严格意义上说是检测高乌头类生物总碱，专属性很差，滴定法测定结果总是偏高。也有文献采用HPLC内标法, 内标法不够简便。其它相关生物碱杂质的检测大多采用TLC法测定，TLC法操作繁杂，人为操作误差大，稳定性和专属性都较差。目前各国药典上尚未收录氢溴酸高乌甲素原料药这个 产品。我国氢溴酸高乌甲素原料的部颁标准中含量测定方法为非水滴定法，滴定法的原理是用高氯酸与生物碱进行碱酸中和反应，以消耗酸的量来计算生物碱的含量，所以，该方法就存在如下问题，跟高氯酸反应的生物碱不只是高乌甲素，其它生物碱一样要与高氯酸发生反应，消耗高氯酸，这样，计算出来的应该是总生物碱，所以经常会出现纯度越低含量越高的现象，比如纯度只有50%的高乌甲素（假设其中N-脱乙酰基高乌甲素<N-deacetyllappaconitine>含量约50%），采用非水滴定法检测，理论上计算的结果就是113%。原因是N-脱乙酰基高乌甲素同样要消耗高氯酸，且克分子量比高乌甲素少，计算的结果更偏高。如按卫生部标准“ 【含量测定】 取本品约0.2g，精密称定，加冰醋酸20ml溶解，加醋酸汞试液5ml,加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.05mol/L)滴定，至溶液显蓝色，将滴定结果用空白试验校正。每1ml的高氯酸滴定液(0.05mol/L)相当于33.28mg的C32H44N2O8·HBr”进行检测。”检测的结果数值误差较大，而且还不能说明其含量就是高乌甲素的含量，在国际贸易中，对高乌甲素质量的检测经常出现一些争议。部颁标准中其他生物碱采用薄层色谱 ( TLC) 法测定。 方法规定为“ 【检查】 其他生物碱 取本品，加甲醇制成每1ml中含4mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇稀释成每1ml中含0.25mg的溶液,做为对照溶液。照薄层色谱法(中国药典1995年版二部附录Ⅴ Ｂ)试验，吸取上述溶液各2μl，分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙腈－水－磷酸(90：10：1.5)为展开剂，展开后，立即置于254nm波长紫外灯下观察，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。”应该方法作为定性鉴别尚可，用为定量检测确是十分的不靠谱。国外客户根本不认同。乌兹别克斯坦的部颁标准，方法规定为“ Сопутствующиеалкалоиды. 0,02 г препарата растворяют в 2 мл метилового спирта (раствор А). К 1 мл раствора А прибавляют 9 мл метилового спирта (раствор Б). К 1 мл раствора Б прибавляют 9 мл метилового спирта (раствор В). К 1 мл раствора В прибавляют 9 мл метилового спирта (раствор Г).На линию старта пластинки ?Merck? с силикагелем 60 F₂₅₄ на алюминиевой подложке наносят микропипеткой или микрошприцом в первую точку 0,01 мл (100 мкг) раствора А, во вторую - 0,01мл (10 мкг) раствора Б, в третью 0,03 мл (3 мкг) раствора В и в  четвертую - 0,05 мл (0,5 мкг) раствора Г.  Пластинку высушивают на воздухе в течение 10 мин, затем помещают в камеру со свежеприготовленной смесью растворителей хлороформ - бензол - диэтиламин (10:40:3). Фронт растворителей должен пройти до конца пластинки. Пластинку сушат на воздухе в течение 10 мин, а затем в сушильном шкафу при t^о110^оС в течение 15 мин. Пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны  254 нм. На хроматограмме из точек 1, 2, 3, 4 должно проявиться основное пятно фиолетового цвета (лаппаконитин, R_f =0,38 На хроматограмме из точки 1 помимо основного пятна (с R_f =0,38) проявляется слабо окрашенное пятно фиолетового цвета (лейконин, R_f =0,45), пятно голубого свечения  (N-дезацетиллаппаконитин, R_f = 0,32. и пятно фиолетового цвета (N-ацетилсепаконитин, R_f =0,27), допускается пятно фиолетового цвета (ранаконитин, R_f =0,23). На старте допускается слабо окрашенное пятно фиолетового цвета. На хроматограмме из точки 2 помимо основного пятна   (с R_f =0,38) проявляются слабо окрашенное пятно голубого свечения (N-дезацетиллаппаконитин, R_f =0,32) и пятно фиолетового цвета (N-ацетилсепаконитин, R_f =0,27). Допускается слабо окрашенное пятно фиолетового цвета (ранаконитин, R_f =0,23). На хроматограмме из точки 3 помимо основного пятна (с R_f =0,38) может проявляться слабо окрашенное пятно голубого свечения (N- дезацетиллаппаконитин, R_f = 0,32). На хроматограмме из точки 4 должно проявиться только одно слабо окрашенное пятно фиолетового цвета (лаппаконитин с R_f =0,38).