[发明专利]一种白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法

权利要求书

1. 一种白灵菇和杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于将白灵菇和杏鲍菇的菌丝体经酶解制备纯化后的原生质体，以白灵菇原生质体热灭活、以杏鲍菇原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将白灵菇和杏鲍菇原生质体融合，并通过颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证得融合株；

所述的酶解液是白灵菇菌丝体酶解液：以0.6mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，配制1ml 1.50%（质量体积比）溶壁酶与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；杏鲍菇的菌丝体酶解液：以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，配制1ml 2.00 % 溶壁酶与1.00% 蜗牛酶为混合酶解液；

所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合：分别将纯化后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照原生质体悬液体积比1:1混合，3000r/min离心10min弃上清，0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬沉淀后逐滴加入等体积30%（质量体积比）PEG6000与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min。

2.权利要求1所述白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于它是按如下的步骤进行：

（1）白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备；

（2）原生质体的制备：白灵菇原生质体制备采用液体静置培养7d的菌丝体，以0.6 mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，在1.50%溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；杏鲍菇原生质体制备采用液体静置培养11d的菌丝体，以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，在2.00% 溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；

（3）原生质体纯化：将步骤（2）所述酶液过滤去除菌丝残片，6000r/min离心获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬，再次6000r/min离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂调节浓度至10⁵个/ml：

（4）原生质体灭活标记：白灵菇原生质体采用55℃热灭活标记处理30min；杏鲍菇原生质体采用紫外灭活采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min标记处理；

（5）双亲原生质体融合：分别将纯化灭活后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照悬液体积比1:1混合，3000r/min离心弃上清，沉淀中逐滴加入 30% PEG6000（聚乙二醇）与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min；

（6）将步骤（4）处理好的原生质体悬液4000r/min离心15min，弃上清液；再用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2次，去除PEG；

（7）融合株再生：将步骤（5）处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂稀释至10⁵个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7~15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。

3.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（1）所述的白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备是指取PDA综合培养基上生长旺盛的两亲本菌丝体前端，分别接种于装有白灵菇和杏鲍菇液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，于25℃静置、暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到白灵菇与杏鲍菇新鲜的菌丝体。

4.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）所述酶解是以0.1g菌丝体（湿重）加入1ml酶解液比例进行酶解反应。

5.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）白灵菇菌丝体原生质体酶解温度34℃，酶解时间3h，杏鲍菇菌丝体原生质体酶解温度34℃，酶解时间2h。