[发明专利]一种白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法

说明书

技术领域

本发明属于食用菌生物技术育种领域，具体涉及一种利用白灵菇与杏鲍菇原生质体融合，获得兼具白灵菇与杏鲍菇二者优势特性的菌盖不易碎、子实体单生菌株的方法。

背景技术

目前传统食用菌育种方式多为人工诱变育种，尚无白灵菇与杏鲍菇原生质体融合方面的报道，由于白灵菇具有久煮不烂、耐运输、易保鲜、货架时间长、耐旱性强、能防癌抗癌、防治老年人心血管病、妇科肿痛、儿童佝偻病和软骨病等优点，但其分解木质素、纤维素、蛋白质能力很弱。而杏鲍菇系一种分解木质素、纤维素、蛋白质能力很强的菌类，富含维生素C、高蛋白、低糖、低脂肪、可降血压、降血脂、预防糖尿病及肥胖症，有改善肠胃、美容等保健功能。但耐旱性弱，菌盖和菌柄质地酥脆，易破裂，人工来去除原基分化产生大量菌蕾，加大了成本。因此培育兼具白灵菇与杏鲍菇二者优势，即能够耐旱、降解木质素、纤维素，提高菌盖韧性，子实体单生新菌株显得尤其重要，可以极大地降低生产成本，培育出优良品种的新菌株。

中国专利：申请号201010523452.X公开了一种草菇和杏鲍菇原生质体融合，它主要是采用单灭活法标记原生质体，并通过0℃低温条件筛选融合株，本发明与其最大的区别是融合过程中采用双灭活原生质体标记法，并通过颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD多种验证融合株方法，更能准确、全面确定融合株的真实性。

目前食用菌育种多为人工诱变方法，由于诱变的不定向特点，用于解决上述问题的效果不佳，查阅资料国内外尚无白灵菇与杏鲍菇原生质体融合报道。

发明内容

本发明目的通过对白灵菇与杏鲍菇原生质体融合方法克服常规育种方式的不足，将白灵菇与杏鲍菇原生质体成功融合融，获得兼有两亲本优良特性即菌盖不易碎、子实体单生新菌株，为实现人工栽培或走发酵工程途径提供菌种资源。

为实现上述目的，本发明公开了一种白灵菇和杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于将白灵菇和杏鲍菇的菌丝体经酶解制备纯化后的原生质体，以白灵菇原生质体热灭活、以杏鲍菇原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将白灵菇和杏鲍菇原生质体融合，并通过菌颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证得融合株。

所述的酶解液是白灵菇菌丝体酶解液：以0.6mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，配制1ml 1.50%（质量体积比）溶壁酶与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；杏鲍菇的菌丝体酶解液：以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，配制1ml 2.00 %溶壁酶与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；

所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合：分别将纯化后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照原生质体悬液体积比1:1混合，3000r/min离心10min弃上清，0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬沉淀后逐滴加入等体积30%（质量体积比）PEG6000与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min。

本发明进一步公开了一种白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于它是按如下的步骤进行：

（1）白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备；

（2）原生质体的制备：白灵菇原生质体制备采用液体静置培养7d的菌丝体，以0.6 mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，在1.50%溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；杏鲍菇原生质体制备采用液体静置培养11d的菌丝体，以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，在2.00%溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；

（3）原生质体纯化：将步骤（2）所述酶液过滤去除菌丝残片，6000r/min离心获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬，再次6000r/min离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂调节浓度至10⁵个/ml：

（4）原生质体灭活标记：白灵菇原生质体采用55℃热灭活标记处理30min；杏鲍菇原生质体采用紫外灭活采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min标记处理；