[发明专利]一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法

权利要求书

1.一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液充分摇匀，取15mL提取液于50mL离心管中，并在65℃水浴中预热；

步骤二，取2.0～3.0g银合欢叶片在液氮中磨成细粉末，转入盛有预热的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液的离心管中，并向离心管中加入0.8mL的β-巯基乙醇、0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋涡混匀10min；

步骤三，在65℃下对离心管水浴20min，每5min上下振荡离心管1次；

步骤四，加入15mL配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀10min，冰浴5min；

步骤五，加冰冷的5mol/L、pH为4.8的醋酸钾(KAc)7mL，轻轻摇动离心管，使上面的液体混匀，冰浴30min；

步骤六，在4℃、18000r/min条件下离心15min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤七，向盛有上清液的离心管中加入等体积的配比为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇混合液，旋涡混匀10min；

步骤八，在4℃、12000r/min条件下，离心10min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤九，加入等体积的配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀5min；

步骤十，在4℃、12000r/min条件下离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中，加入0.3mL的β-巯基乙醇，再加入相当于上清液体积1/3的8mol/L的LiCl溶液，在-30℃下放置8h；

步骤十一，将离心管置于冰上解冻，在4℃、18000r/min条件下离心10min，弃上清液；

步骤十二，将沉淀用1mL75％的乙醇冲洗，转入1.5mL离心管中，在4℃、15000r/m条件下离心15min，弃上清液；

步骤十三，用0.8mL75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃、13000r/min条件下离心5min，弃上清液；

步骤十四，将试管置于超净工作台上，并倒放在灭菌滤纸上，凉干5～10min；

步骤十五，加入50μL经1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子双蒸水，将沉淀溶解后置-80℃保存备用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法所用到的塑料离心管、移液抢头均用1g/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌，烘干备用；研钵及金属药匙用锡箔纸包好，并在180℃烘箱中烘烤8h。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用紫外分光光度计分别测定样品在260n  m  、280nm处的OD值，通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可对RNA质量进行检测。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，纯净的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应在1.7-2.0之间，否则表明样品中有蛋白质或酚试剂的污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值大于2.0则表明样品中有小分子、盐和DNA的污染；

该方法所提取的银合欢叶片组织总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0；RNA的浓度在9.0～11.0μg/μL，2.0～3.0g的银合欢叶片可得到400～600μg的总RNA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，取部分RNA提取液进行1.5％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测，通过分析带型可判断所提取RNA的完整性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法获得的RNA提取液经1.5％琼脂糖凝胶变性电泳检测条带清晰，且28S亮度为18S的1.9～2.1倍，完全可用于银合欢分子生物学相关研究。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法所选用的银合欢植株的叶片为2～3月龄。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法提取银合欢叶片组织中总RNA时，采用UNIVERSAL32R型高速冷冻离心机进行离心处理。