[发明专利]一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，尤其涉及一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法。

背景技术

银合欢原产美洲，是一种重要的热带、亚热带木本豆科牧草和速生林树种，可以用于饲料、绿肥、燃料、林木及植物修复、水土保持、培养食用菌、保健和药用等，被联合国粮农组织的饲料专家誉为干旱地区的“  蛋白质仓库”和“奇迹树”  。我国于1957年开始进行银合欢引种栽培研究，并选育“热研1号银合欢”  。目前，银合欢异木虱已成为影响银合欢种植和利用的最主要害虫。银合欢抗异木虱育种已成为急待解决的问题，然而，作为热带豆科木本牧草的银合欢育种时间长，特别是仅凭表现型选择亲本具有不确定性。应用分子标记辅助育种，可以合理筛选亲本、加速育种进程。

从生物组织中提取高质量的总RNA对于分析基因的表达和调控、基因克隆及其功能鉴定、分子标记辅助育种等具有重要意义。不同生物组织，特别是高等植物，常常由于富含多酚氧化物、多糖、蛋白质等，使得其总RNA提取十分困难。银合欢植物叶片中粗蛋白质含量为22％～29％、含羞草素2％～5％，其总RNA提取更加困难。本发明人查阅了大量的文献，均未发现银合欢叶片总RNA的提取报道。

发明内容

本发明提供了一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，旨在解决目前无法从银合欢叶片提取总RNA的问题。

本发明的目的在于提供一种提取银合欢叶片组织中总RNA的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一，将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液充分摇匀，取15mL提取液于50mL离心管中，并在65℃水浴中预热；

步骤二，取2.0～3.0g银合欢叶片在液氮中磨成细粉末，转入盛有预热的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液的离心管中，并向离心管中加入0.8mL的β-巯基乙醇、0.9～1.0g的交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋涡混匀10min；

步骤三，在65℃下对离心管水浴20min，每5min上下振荡离心管1次；

步骤四，加入15mL配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀10min，冰浴5min；

步骤五，加冰冷的5mol/L、pH为4.8的醋酸钾(KAc)7mL，轻轻摇动离心管，使上面的液体混匀，冰浴30min；

步骤六，在4℃、18000r/min条件下离心15min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤七，向盛有上清液的离心管中加入等体积的配比为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇混合液，旋涡混匀10min；

步骤八，在4℃、12000r/min条件下，离心10min，将上清液转入另一支50mL的离  心管中；

步骤九，加入等体积的配比为24∶1的氯仿与异戊醇混合液，旋涡混匀5min；

步骤十，在4℃、12000r/min条件下离心10min，将上清液转入另一支50mL的离心管中，加入0.3mL的β-巯基乙醇，再加入相当于上清液体积1/3的8mol/L的LiCl溶液，在-30℃下放置8h；

步骤十一，将离心管置于冰上解冻，在4℃、18000r/min条件下离心10min，弃上清液；

步骤十二，将沉淀用1mL75％的乙醇冲洗，转入1.5mL离心管中，在4℃、15000r/m条件下离心15min，弃上清液；

步骤十三，用0.8mL75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃、13000r/min条件下离心5min，弃上清液；

步骤十四，将试管置于超净工作台上，并倒放在灭菌滤纸上，凉干5～10min；

步骤十五，加入50μL经1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子双蒸水，将沉淀溶解后置-80℃保存备用。

进一步，该方法所用到的塑料离心管、移液抢头均用1g/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌，烘干备用；研钵及金属药匙用锡箔纸包好，并在180℃烘箱中烘烤8h。

进一步，采用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280n  h处的OD值，通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可对RNA质量进行检测。

进一步，纯净的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值应在1.7-2.0之间，否则表明样品中有蛋白质或酚试剂的污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀的比值大于2.0则表明样品中有小分子、盐和DNA的污染；