[发明专利]用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫组化试剂，尤其是一种用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法。

背景技术

乳腺组织常含有多种抗原成分，表达于不同种类细胞的细胞膜、细胞质和细胞核不同部位。乳腺疾病病理诊断要显示肌上皮、腺上皮组织的不同抗原，往往需要用多种抗体分别在多张切片上染色标记，若肌上皮连续存在则无浸润癌，若肌上皮阴性反应则为乳腺浸润癌（盲管腺病除外）。单种抗体显示，导管原位癌肌上皮细胞胞呈跳跃性阳性，肌上皮不连续。若在一张切片上同时显示多种组织抗原，往往需要在一张切片上采用多次标记反复标记，5种抗体就要5次染色，方法烦琐，染色时间长，且在一张切片上反复操作容易引起组织脱落，从方法学角度也费时费力。

发明内容

本发明的技术任务时针对以上现有技术的不足而提供一种用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法，该试剂由以下重量份的抗体组成：鼠抗人CK8/18 免疫组化单克隆抗体20%、即用型钙调节蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、即用型P63蛋白鼠抗人单克隆抗体20%、肌动蛋白HHF-35鼠抗人单克隆抗体20%，其制作方法是分别等量吸取上述各组分抗体，然后进行混合，在旋涡混合器上旋转混匀或者吸管吹打混匀即可，并置4℃冰箱内保存备用。

用于鉴别乳腺肌上皮病变的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、把采集的乳腺肌上皮组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行石蜡包埋后，进行切片，厚度为3-5um，对疑有病变的组织选作免疫标记，在温度为58℃-60℃下，放到恒温箱内烤切片2-3小时，切片上的石蜡经过脱蜡、水化后，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟；

步骤二、将切片经内源性过氧化物酶阻断，用浓度为3%的新鲜配制的过氧化氢孵育切片5分钟，然后用蒸馏水冲洗切片2次，每次3分钟；

步骤三、用EDTA修复液对切片进行抗原修复；

步骤四、向切片加非免疫动物血清，室温下孵育切片10分钟；

步骤五、除去切片上的非免疫动物血清，向切片加多重染色试剂，在17℃—33℃温度下孵育切片30-60分钟；

步骤六、加使MACH 2 Double Stain酶标二抗试剂，室温孵育切片30分钟，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟，再用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；

步骤七、除去切片上的蒸馏水后，加AP-red显色剂室温孵育切片10-20分钟，用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟，在显微镜下观察，掌握染色时间，阳性信号为红色，观察完成后，用TBS液冲洗切片3次，每次3分钟，再用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟，然后采用pH值为2.0，浓度为0.05% HCl室温孵育切片30 分钟，用TBS液冲洗切片2次，每次3分钟；

步骤八、加DAB显色剂室温孵育切片5分钟后，用蒸馏水冲洗切片2次，每次3分钟，在显微镜下观察，掌握染色时间，阳性信号为黄色或者棕黄色，观察完毕后，用蒸馏水冲洗切片3次，每次3分钟；

步骤九、除去切片上的蒸馏水，加苏木精浅染30-60秒后，用蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；

步骤十、除去切片上的蒸馏水，在切片未干时，直接滴加水性封片剂封片，60℃烘干15-30分钟，水性封片剂干燥后，待自然冷却，再用中性树胶封片即可。

    在上述步骤一中所述石蜡的熔点小于60℃。

    在上述步骤三中所述EDTA修复液为在100℃温度下煮沸20 分钟，其pH为8.0。

    在上述步骤七中所述AP-red显色剂为现用现配。

本发明多重染色试剂在标记乳腺肌上皮细胞时，具有较强的特异性和敏感性。可以分别对同一靶细胞内不同的靶抗原进行识别，使细胞核、细胞膜和细胞质同步着色，明显增加了肌上皮细胞的反应性和敏感性，更能客观地显示出乳腺腺泡和导管的基本结构，对乳腺病变的诊断起到很好的辅助作用。

通过实验观察，我们发现本发明多重染色试剂用于免疫组织化学标记具有抗体优势互补的效应，两种抗体能分别与相同细胞的不同靶抗原起反应，共同识别靶细胞，提示该技术有协同检测肿瘤组织来源的潜力，尤其有助于肿瘤病理诊断。

该方法目前只适用于抗原不在相同位置的双标记，尚不适用于两抗原可能在同一定位的检测。

本发明产生技术效果如下：

1、能同步标记不同组织的两种靶细胞，又能标记相同靶细胞中不同的靶抗原；