[发明专利]一种用于检测合成肽抗原浓度的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是涉及一种用于检测合成肽抗原浓度的检测方法。

背景技术

蛋白质是一种十分重要的生物大分子，种类很多，结构不均一，分子量相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质蛋白定量分析的方法带来了许多具体的困难。目前测定蛋白质蛋白含量的方法有很多种，都是根据蛋白质蛋白不同性质建立的一些蛋白质测定方法，包括：紫外分光光度法、凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚试剂法(Lowry法)、二辛可宁酸法(BCA法)、胶体金法、考马氏亮蓝染色法、银染法、荧光法等。

蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而福林酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种灵敏性强、样品用量小、检测范围广、针对性强的用于检测合成肽抗原浓度的检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于检测合成肽抗原浓度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制标准合成肽溶液，将已知浓度的合成肽溶液先用蒸馏水稀释至浓度为1mg/ml，然后继续稀释至不同梯度浓度，即为配制的标准合成肽溶液样品；

(2)配制合成肽样品：将未知浓度的合成肽样品采用蒸馏水连续稀释至不同梯度浓度；

(3)以碱性酒石酸铜溶液作为A试剂，斐林试剂作为B试剂，将A试剂置于比色皿中，加入待检测样品，混合均匀，A试剂与待检测样品的体积比为5∶1；所述的待检测样品为标准合成肽溶液样品或者合成肽样品；

(4)继续加入B试剂，于室温避光反应20分钟，反应完全后，利用分光光度计测量OD750的吸光值，所述B试剂与A试剂的体积比为8∶1；

(5)根据标准合成肽溶液样品各梯度样品对应的数据绘制标准曲线，然后对合成肽样品吸光值对应标准曲线进行换算，计算得到相应的浓度值。

步骤(1)所述的已知浓度的合成肽溶液由市售合成肽样品冻干粉采用蒸馏水溶解精准定出浓度，所述不同梯度浓度的标准合成肽溶液样品的稀释倍数为1～32倍。

步骤(2)所述不同梯度浓度的合成肽样品的稀释倍数为1倍、5倍、10倍或20倍，每个样品皆重复2-3倍。

所述的碱性酒石酸铜溶液的浓度为1g/L，pH值为10。

本发明为检测合成肽抗原浓度的比色分析法，根据合成肽抗原蛋白质与碱性酒石酸铜溶液(alkaline copper tartrate solution)及斐林试剂(Folin reagent)之反应呈色。呈色反应分成两个步骤：首先反应作用在铜与蛋白质之间，接着与铜反应之蛋白质再与斐林试剂进行还原反应。呈色反应主要由胺基酸中酪氨酸(tyrosine)和色氨酸(tryptophan)造成，少数则由胱安酸(cystine)、半胱氨酸(cysteine)和组氨酸(histidine)形成。蛋白质在斐林试剂参与的还原反应下，减少一至三个氧原子，因此产生一个或多个可能被还原的蓝色物质，其在波长750nm下有最大吸光值。

与现有技术相比，本发明用福林酚试剂法测定合成肽抗原中蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲法高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦但比之前采用的凯氏定氮法方便很多，节省时间提高工作效率，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，结果稳定可重复性好；与现有福林酚试剂法相比，本发明克服了因干扰因素较多带来的缺点，采用合成肽作为线性标准品，标准合成肽产品(2570或7309)由冻干粉称量后溶解精准定出标准品的浓度(Reference peptide)，用该标准品来检测合成肽产品(2570或7309)使得该法针对性和专一性更好，因而克服了杂质干扰，使检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

一种用于检测合成肽抗原浓度的检测方法，包括以下步骤：