[发明专利]一种绣球菌抗肿瘤免疫活性的检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种绣球菌抗肿瘤免疫活性的检测方法，用于标示绣球菌的抗肿瘤免疫活性。

技术背景：

本发明主要针对绣球菌进行抗肿瘤免疫活性的检测和标示，同时适用于其他食用菌或药用菌的抗肿瘤免疫活性的检测和标示。

绣球菌是药食两用大型真菌，生活条件苛刻，资源蕴藏量比较稀少，是一种非常珍稀名贵的食用菌，在食用菌中仅次于冬虫夏草、羊肚菌、块菌等珍品。因野生绣球菌稀少，而人工培养难度大，因此有“梦幻之菇”之称。直至近几年才实现绣球菌的人工栽培。

绣球菌营养丰富，含多种维生素、氨基酸等成分，最突出的特点是葡聚糖含量高，其葡聚糖含量是菇类之最。已有实验表明，绣球菌葡聚糖含量占绣球菌干重的40%以上，是灵芝、姬松茸葡聚糖含量的数倍，其中β-1,3-D葡聚糖含量占葡聚糖总量的70%左右，而大多具有抗肿瘤活性的多糖都是带有1,6分支的β-1,3-D葡聚糖。专家们通过X-射线绕射分析得知，β-1,3-D-glucan呈现的独特螺旋结构及侧链上的多肽、脂类基团是发挥抗肿瘤功能的重要成因，其分子结构含有蛋白组分，属于绣球菌葡聚糖蛋白复合体（Sparassis crispa(Wulf.)Fr.Glucan Protein，SGP）。

研究发现，与多数食用菌多糖一样，SGP具有抗肿瘤活性，且该活性较其他多糖活性高。临床试验已经证实SGP对于肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症有很好的抑制效果。SGP不仅有抗肿瘤活性，而且可以提高机体造血功能。

目前，关于绣球菌的研究多集中在培养条件的优化、绣球菌葡聚糖的提取工艺、绣球菌葡聚糖及其他成分的活性研究，但对于绣球菌的活性检测方法尚未见报道。随着生活质量的提高，食品及保健品行业的迅速发展，绣球菌也将应用到各领域中。因此，建立一种绣球菌的活性检测方法，并且用通俗易懂的方式直观地表示出来，对于绣球菌类产品的推广应用具有深远意义。所述绣球菌的活性检测方法也适用于其它食用菌或药用菌的抗肿瘤免疫活性检测。

发明内容：

针对绣球菌现有研究，本发明的目的在于设计提供一种绣球菌抗肿瘤免疫活性检测方法的技术方案，用于标示和区分绣球菌产品，使其生物活性直观通俗地表达出来，便于人们选用此类产品。

科学家们研究发现，SGP对肿瘤、糖尿病、心血管疾病等有惊人的效果，被誉为“免疫黄金”。SGP经过化学方法处理后其生物学功能消失殆尽，原因在于破坏了SGP的螺旋结构、分支及侧链上的活性基团。由此可知，SGP的生物活性与葡聚糖的分子量、分子构型、支链结构有关。

由于绣球菌生物活性成分SGP，结构复杂，纯化困难，过度纯化的SGP，天然结构被破坏，从而失去其固有的生物活性。纯化的SGP，葡聚糖含量高，而没有天然生物活性，因而检测绣球菌产品的葡聚糖含量，对评价绣球菌产品的生物活性意义不大，开发一种能标示绣球菌生物活性的检测方法，直接检测绣球菌产品的生物活性，非常有必要。

SGP的抗肿瘤免疫活性可用抗肿瘤免疫活性因子水平（Anticancer Immune Factor，ACIF）标示。SGP具有抗肿瘤免疫活性，但其提高机体的免疫调节能力并非直接作用于肿瘤细胞和病原微生物，而是通过刺激、激活免疫细胞释放细胞因子发挥作用。IFN-γ是由活性淋巴细胞产生的，具有抗病毒、抗肿瘤活性，参与免疫调节。因此，IFN-γ浓度的高低可作为机体免疫调节能力的一种评价指标。

刀豆素A（ConA），是一种植物凝集素，可以诱导细胞产生IFN-γ等细胞因子。

本发明采用单核细胞株THP-1细胞，通过该细胞经绣球菌刺激后所产生细胞因子INF-γ的表达量，与ConA诱导产生的INF-γ的表达量比较，用相应ConA的浓度评价绣球菌的生物活性，标示为ACIF值，直观标示绣球菌产品的生物活性。

本发明的有益效果是：实现了绣球菌抗肿瘤免疫活性的高通量检测，直观标示绣球菌产品的抗肿瘤免疫活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本发明为定量测定食用菌或药用菌生物活性提供了基础。

一种绣球菌抗肿瘤免疫活性的检测方法,其特征在于包括以下工艺步骤：

1）取绣球菌葡聚糖蛋白复合体（SGP）样品，配制成溶液；

2）取THP-1细胞，调整细胞密度至10⁵～10⁶个/ml；

3）向步骤2）中培养得到的细胞中加入步骤1）的SGP溶液至终浓度达到10μg～2.0mg/ml，然后进行培养；

4）取步骤3）得到的培养物离心后收集细胞上清液；