[发明专利]筛选与固定高效石油烃降解菌群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选与固定石油烃降解菌群的方法，具体涉及一种筛选和固定高效石油烃降解菌群应用于修复海洋石油污染环境的技术方法，其属于环境修复技术领域。 

背景技术

近年来，随着海底石油资源的大力开采和原油贸易量的增加，海洋溢油事故频发，导致海洋环境面临前所未有的压力。无论溢油事故发生在海洋表层还是底部，采取物理和化学方法去除大部分油污后，海洋中都会残留一部分不可回收的石油，危害海洋自然生态环境。因此需采取必要的生态环境修复手段。 

生物修复是进行生态修复工作的最经济有效的手段。目前微生物修复方法主要为两类：生物刺激法和投加菌剂法。生物刺激法是通过向污染区域添加营养盐或氧化剂刺激微生物的生长，从而提高微生物修复效率，此方法对营养贫瘠的海区尤为有效；投加菌剂法是向污染区域投放高效降解污染物的菌剂以提高污染物降解效率。海洋中常见的细菌有假单胞菌属 （Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、无色杆菌属 (Achromobacter)、黄杆菌属（Flavobacterium）、螺菌属(Spirillum)、微球菌属（Micrococcus）、八叠球菌属(Sarcina)、芽孢杆菌属（Bacillus）等，虽然海洋中大部分土著菌群具有降解石油污染的能力，但是石油污染会导致土著菌群大面积灭亡。因此可以采用投加菌剂法补充修复微生物群落，进而修复石油污染。构建高效微生物菌群降解石油污染是目前最有效的修复策略，微生物之间存在协同关系、拮抗关系和竞争关系等。从而如何合理构建最优的高效石油烃降解菌菌群，并保证将其投放在自然海区中正常生长，是该技术应用的主要瓶颈。 

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在筛选高效石油烃降解菌的基础上，科学合理地确定高效石油烃降解菌群的最优组合方案，并克服其在自然海区无法生长的问题。 

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为筛选与固定高效石油烃降解菌群的方法，其步骤如下： 

第一步：选取石油污染海区采集沉积物样品5g；

第二步：将样品加入含有1%柴油的液体无机盐培养基中；无机盐培养基成分为NaCl：22.0g，MgSO₄·7H₂O：2.0g，NH₄NO₃：1.0g，KCl：0.5g，KH₂PO₄：1.0g，Na₂HP0₄：3.0g，CaCl₂：0.1g，FeCl₃：0.005g，MnSO₄：0.002g，ZnCl₂:0.002g，蒸馏水1000mL；

第三步：采用含有1%柴油的固体无机盐培养基对第二步的石油烃降解菌进行涂布分离、纯化，并在4℃保种；所述固体无机盐培养为第二步中的液体无机盐培养基加入琼脂15g；

第四步：从第三步保种的石油烃降解菌中选取n株菌落形态和细胞形态各异的菌，测定单菌株的石油烃降解率，采用PCR方法扩增16S rDNA进行分子鉴定；

第五步：将n株菌混合培养，同时从n株菌中随机选出（n-1）株组合成 组组合不同的搭配混合培养，检测n组组合的石油烃降解率，确定石油烃降解菌群组合方案；

第六步：将第五步选定的石油烃降解菌群组合固定化，所述固定化选用海藻酸钠为固定化载体；石油烃降解菌群培养液与固定化载体的比例为1:2混合，用无菌注射器抽取含有石油烃降解菌群和海藻酸钠的混合液滴落至CaCl₂溶液中，静置30min，制成直径1~2 cm可沉降的固定化菌球，并4℃保存在无菌海水中。

所述n大于等于3。 

所述PCR引物为27F（5-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3′）与1492R(5-TACggTTACCTTgTTACgATCC-3′)。 

本发明的有益效果为：其提出一种科学合理、简便可行、符合优化组合原则的筛选高效石油烃降解菌群方法，各组合菌株之间存在协同作用，组合后的效果优于各菌株单独作用的效果，外源菌群净化功能和沉积物生态系统自净功能有机结合；本发明将高效石油烃降解菌群固定化包埋成球状，投放于石油污染环境之中进行微生物降解，首先，固定化菌球比菌液方便运输，投放均匀；其次，包埋固定载体给微生物留有适宜的生存空间缓冲石油污染的冲击；再次，固定化菌球可沉降至海底，修复海洋底层石油污染。