[发明专利]通过杂交进行的随机阵列DNA分析

说明书

本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2004/006022，国际申请日为2004年2月26日，进入中国国家阶段的申请号为200480010806.3，名称为“通过杂交进行的随机阵列DNA分析”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的相互参照

本申请要求2003年2月26日提交的美国临时申请60/450，566的优先权，其题目为“通过杂交进行的随机阵列DNA分析”，代理人审理号CAL-2。相关主题公开于共有、共待审的2003年12月16日提交的美国专利申请10/738,108，题目为“通过用探针分子编制多个瞬时相互作用进行的单靶分子分析”，代理人审理号CAL-3，其要求2002年12月20日提交的美国临时申请60/435，539的优先权，该临时申请的题目为“通过用探针分子编制多个瞬时相互作用进行的单靶分子分析”，代理人审理号30311/39054。这些和所有其他专利和专利申请纳入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及分析分子的方法和进行这种分析的装置。方法和装置对单分子核酸进行可信赖的分析。这种单分子可来自天然样品，如不分离或富集的单个组分细胞、组织、土壤、空气和水。在本发明的某些方面，方法和装置是用于进行核酸序列分析或核酸定量包括基因表达。

背景技术

有三种建立的DNA测序技术。今天使用的主要测序方法是基于Sanger’s双脱氧链终止法(Sanger等，美国国家科学院院刊74:5463(1977)，以整体纳入本文作为参考)，依赖于各种基于凝胶的分离设备，从手工系统到完全自动化的毛细管测序仪。Sanger法在技术上是困难的，而且阅读长度限制在约1kb或更短，要求多次阅读以达到高准确度。第二种方法－焦测序(pyrosequencing)也用聚合酶产生序列信息，即通过监测在测试具体DNA碱基掺入生长链的连续循环期间产生的焦磷酸盐进行 (Ronaghi,基因组研究11:3(2001)，整体纳入本文作为参考)。该方法提供优秀的多孔板测定，但是仅用于非常短的10-50碱基片段的局部测序。此阅读长度限制对于基于序列的诊断是一个严重的限制。

上面两种技术代表直接测序法，其中链上每个碱基的位置是由直接试验顺序决定的。杂交测序(SBH)(美国专利5,202,231；Drmanac等，基因组学4:114(1989)，将两者整体纳入本文作为参考)，使用互补核酸的碱基特异性杂交的基础生命化学，间接组装靶DNA的碱基顺序。在SBH中，将已知序列的重叠探针杂交至样品DNA分子，使用计算机算法所得的杂交模式用来产生靶序列(共有、共待审美国专利申请09/874,772；Drmanac等，科学260:1649-1652(1993)；Drmanac等，Nat.Biotech.16:54-58(1998)；Drmanac等，“用寡核苷酸探针杂交进行DNA测序和指纹分析”，分析化学百科全书，第5232-5237页(2000)；Drmanac等，“杂交测序(SBH)：优点、成就及机会”，生化工程/生物技术进展：芯片技术，Hoheisel，J.(编辑)，第76卷，第75-98页(2002)；所有以整体纳入本文作为参考)。探针或DNA靶可以高密度阵列的形式排列(例如参见Cutler等，基因组研究11:1913-1925(2001)，整体纳入本文作为参考)。SBH法的优点包括实验的简单性，阅读长度较长、准确度较高和单一测定中可分析多个样品。

当前，迫切需要在复杂样品中可以快速并准确地检测、分析和鉴定所有潜在的病原体的新生物防御技术。现有病原体探测技术通常缺乏在样品中准确鉴定痕量的病原体的灵敏性和选择性，并且难以操作。此外，在它们的现有应用中，所有三个测序技术都需要大量的样品DNA。通常用几种扩增方法之一制备样品，主要是PCR。虽然与DNA扩增和序列制备有关的费用相当大，但是这些方法，尤其SBH可以提供良好的个体基因或2-5个基因混合物的基于序列的诊断。因此，所有现有测序方法都缺乏以接受的费用水平在复杂生物样品中进行全面的基于序列的病原体诊断和筛选提供所需的速度和效率。这在现有技术能力和新的测序需求之间造成大的差距。理想的是，合适的诊断方法应该允许对环境或临床样品中可能存在的所有重要病原体同时进行筛查，样品包括隐藏在生物体中的工程改造的病原体混合物。