[发明专利]一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法

权利要求书

1.一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是将三角帆蚌外套膜组织进行原位杂交，根据外套膜组织原位杂交的结果对目的基因进行基因定位，其特征在于，所述的外套膜组织原位杂交所用的探针为针对目的基因的探针，所述的目的基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述的探针的序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的外套膜组织原位杂交包括以下步骤：

（1）将三角帆蚌外套膜组织进行固定；

（2）将固定好的外套膜组织进行切片；

（3）将组织切片进行预处理；

（4）将预处理后的组织切片进行杂交；

（5）杂交后的处理与检测。

3.根据权利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步骤（1）是将三角帆蚌外套膜组织用4%多聚甲醛溶液在温度4℃下固定24 h，然后用DEPC水配制的1×PBS溶液洗涤组织。

4.根据权利要求3所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的4%多聚甲醛溶液的溶质为多聚甲醛，溶剂为PBS，多聚甲醛的终浓度为4%（质量百分含量），所述的PBS的制备方法为：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄ 0.24g，用DEPC-H₂O 配至1 L，调pH值至7.4。

5.根据权利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，所述的步骤（2）是将固定后的外套膜组织切成厚度为7～10 μm的组织切片，并将烘烤后的切片保存于4℃冰箱。

6.根据权利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，步骤（3）中所述的预处理按照如下步骤进行：

（a）将组织切片分别进行第一次二甲苯脱蜡5 min、第二次二甲苯脱蜡5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脱蜡5 min；

（b）然后依次经过第一次无水乙醇清洗10 min、第二次无水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、1×PBS溶液清洗10 min；

（c）然后再依次经过Triton X-100清洗10 min、1×PBS溶液清洗10 min、37℃下含5 μg/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2%（质量百分含量）甘氨酸溶液清洗5 min、第一次1×PBS溶液清洗5 min、第二次1×PBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5 min；

（d）固定后再用1×PBS溶液清洗两次，每次均清洗5 min，组织切片放入55℃去离子甲酰胺和1×SSC的等量混合液中浸泡30 min。

7.根据权利要求2所述的三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，其特征在于，步骤（4）中所述的杂交条件为：杂交液中加入终浓度为1.0 μg/mL的探针，混合均匀，75℃加热5 min后，冰上急冷，然后将杂交液滴片到组织切片上，于55℃的杂交炉中孵育16～20 h。