[发明专利]一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法。

背景技术

三角帆蚌是我国最主要的优质淡水育珠蚌，具有重要的经济价值。育珠蚌的外套膜能分泌物质形成贝壳，还能分泌珍珠质形成珍珠。淡水蚌的蚌壳通常可分为角质层、棱柱层和珍珠层三层结构，而外套膜不同部位的组织细胞具有形成不同贝壳结构的作用。通常认为角质层由外套膜边缘的生壳突起分泌形成，棱柱层由外套膜边缘膜的高柱状细胞分泌形成，珍珠层由外套膜中央膜的柱状细胞分泌形成。优质淡水珍珠中主要含有较厚的珍珠层而含较少的棱柱层结构。因而，研究育珠蚌的外套膜对成壳和育珠的作用对于提高和改善育珠蚌的珍珠质量具有非常重要的意义。

目前，对贝壳和珍珠形成机制的研究主要集中在参与矿化作用的蛋白和多肽的分离及其基因的克隆，而有关基因的功能研究还存在很多困难。研究功能基因的定位，尤其是研究相关基因在参与贝壳和珍珠形成中起重要作用的外套膜中的定位情况，将有助于了解相关基因的功能，揭示其在生物矿化中的作用，从而为提高养殖珍珠的产量和质量提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种三角帆蚌外套膜目的基因的定位方法，是将三角帆蚌外套膜组织进行原位杂交，根据外套膜组织原位杂交的结果对目的基因进行基因定位，所述的外套膜组织原位杂交所用的探针为针对目的基因的探针，所述的目的基因是三角帆蚌SRCR-1基因，GenBank登录号为accession no. KC691745，其序列如SEQ ID No.1所示，所述的探针的序列如SEQ ID No.2所示。

所述的外套膜组织原位杂交包括以下步骤：

（1）将三角帆蚌外套膜组织进行固定；

（2）将固定好的外套膜组织进行切片；

（3）将组织切片进行预处理；

（4）将预处理后的组织切片进行杂交；

（5）杂交后的处理与检测。

所述的步骤（1）是将三角帆蚌外套膜组织用4%多聚甲醛溶液在温度4℃下固定24 h，然后用DEPC水配制的1×PBS溶液洗涤组织。

所述的4%多聚甲醛溶液的溶质为多聚甲醛，溶剂为PBS，多聚甲醛的终浓度为4%（质量百分含量），所述的PBS的制备方法为：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄ 0.24g，用DEPC-H₂O 配至1 L，调pH值至7.4。

所述的步骤（2）是将固定后的外套膜组织切成厚度为7～10 μm的组织切片，并将烘烤后的切片保存于4℃冰箱。

步骤（3）中所述的预处理按照如下步骤进行：

（a）将组织切片分别进行第一次二甲苯脱蜡5 min、第二次二甲苯脱蜡5 min、二甲苯和酒精的等量混合液脱蜡5 min；

（b）然后依次经过第一次无水乙醇清洗10 min、第二次无水乙醇清洗10 min、95%乙醇清洗5 min、90%乙醇清洗5 min、80%乙醇清洗5 min、70%乙醇清洗5 min、1×PBS溶液清洗10 min；

（c）然后再依次经过Triton X-100清洗10 min、1×PBS溶液清洗10 min、37℃下含5 μg/mL蛋白酶K的PBS溶液清洗15 min、0.2%（质量百分含量）甘氨酸溶液清洗5 min、第一次1×PBS溶液清洗5 min、第二次1×PBS溶液清洗5 min，用4%多聚甲醛溶液滴片固定5 min；

（d）固定后再用1×PBS溶液清洗两次，每次均清洗5 min，组织切片放入55℃去离子甲酰胺和1×SSC的等量混合液中浸泡30 min。

步骤（4）中所述的杂交条件为：杂交液中加入终浓度为1.0 μg/mL的探针，混合均匀，75℃加热5 min后，冰上急冷，然后将杂交液滴片到组织切片上，于55℃的杂交炉中孵育16～20 h。

所述的步骤（5）按照如下步骤进行：

（a）杂交后的组织切片用甲酰胺和1×SSC的等量混合液于55℃下洗涤两次，每次均洗涤30 min；