[发明专利]一种具有甘露糖化修饰的溶菌酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种具有甘露糖化修饰的溶菌酶及其应用。

背景技术

溶菌酶是一类抗菌能力强大、抗菌谱广、种类多样、可供选择范围广、靶菌株不易产生抗性突变的碱性蛋白质。溶菌酶一般由129个氨基酸残基组成，分子量在14kDa左右，在酸性条件(pH=4～7)下，100℃处理1min后仍能保持原活性，但在碱性环境下热稳定性较差，溶菌酶最适pH值为6.6，等电点为10.5～11。人溶菌酶(humanlysozyme)属于c型溶菌酶，由130个氨基酸组成，分子量为14.7kD，含有4个二硫键。人溶菌酶具有高生物活性和热稳定性，其杀菌活性是目前市场常用的鸡蛋清溶菌酶的3倍，同时，人溶菌酶还具有抗病毒、增强免疫力以及抗肿瘤的功效，在临床中具有较高的应用价值。

溶菌酶的作用及其机理与传统的抗生素不同，溶菌酶不仅具有广谱抗细菌能力，且对病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。同时，在体外与传统抗生素一样通过试管或平皿法可观察到杀菌作用。目前，关于人溶菌酶的作用机理的研究大都集中在人溶菌酶与细菌细胞壁作用方面。溶菌酶的生物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁，研究表明，由于革兰氏阳性细菌外部没有由脂多糖、磷脂、糖脂组成的外膜覆盖，所以溶菌酶对它们的作用较强。然而溶菌酶自身的特点决定了溶菌酶的使用均只能针对细胞外的细菌产生直接作用。目前研究发现的细胞内病原体所致感染是危害人类健康的顽疾之一。结合分枝杆菌、伤寒沙门氏菌等常见胞内菌入侵机体后，已演化出不同机制来逃避机体的免疫：如结合分枝杆菌在被巨噬细胞吞噬后能改变所在吞噬泡的特征，使吞噬泡不能与溶酶体融合而避开了溶酶体中为数众多的水解酶类(包含溶菌酶)的降解作用而长期寄生在胞内；反使巨噬细胞成为其庇护所又躲过体液免疫，在机体免疫力下降时进行繁殖形成慢性持续性的感染。又因大多数抗生素及抗菌药在巨噬细胞内浓度低难以杀死寄生菌，致使临床治疗胞内菌存在一定困难，而至今无有效治疗手段。人溶菌酶能杀死革兰氏阳性菌对革兰氏阴性菌也有一定的抑菌作用，但至今也没有利用溶菌酶等有效的方法来治疗胞内菌。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种甘露糖化修饰的溶菌酶；第二个目的在于提供编码所述溶菌酶的基因；第三个目的在于提供包含所述溶菌酶基因的重组载体；第四个目的在于提供包含所述溶菌酶基因或重组载体的重组菌株；第五个目的在于提供制备所述溶菌酶的方法；第六个目的在于提供所述溶菌酶在杀死胞内菌中的应用。

本发明所述甘露糖化修饰的溶菌酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；或将序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列；或与上述限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列。或其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或将序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列；或与上述限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列。所述氨基酸序列经过N-糖基化修饰位点N-X-S/T修饰,其中X为除脯氨酸外的氨基酸。所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列是在修饰前氨基酸序列(SEQ IDNo.3)的C端增加一段具有2个N-糖基化修饰位点的氨基酸序列NGTGNASG，在未改变抑菌活性的前提下，得到具有甘露糖化修饰的溶菌酶。

所述SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是将修饰前氨基酸序列(SEQID No.3)的第116位和第120位发生突变，序列NRCQNRD中的C突变为T，D突变为S，从而获得具有2个N-糖基化修饰位点的序列NRTQNRS，在未改变抑菌活性的前提下，得到了具有甘露糖化修饰的溶菌酶突变体。

优选地，所述溶菌酶的修饰位点位于氨基酸序列的C端。

本发明还提供了编码所述溶菌酶的基因。

优选地，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选地，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了包含上述溶菌酶基因的重组载体。

优选地，重组载体为pPICZαA-hLYZ重组载体，在载体pPICZaA中AOX启动子下游Xho I和Xba I位点间插入hLYZ基因，其中所述hLYZ基因3’端引入包含2个N-糖基化位点序列的一段连接序列：AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT（划线部分为糖基化位点序列）。