[发明专利]灰杨组培体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种灰杨组培体系的建立方法。

背景技术

灰杨(Populus×canescens＝Populus tremula×P.alba)为杨柳科(Salicales)杨属(Populus)植物，是荒漠河岸林的主要组成树种。在自然条件下，前人主要通过灰杨种子和根蘖繁殖来扩大种群范围的研究报道，但迄今为止，尚未见到有关灰杨遗传转化再生体系的研究文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰杨组培体系的建立方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及灰杨组培体系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选取健壮灰杨植株，将灰杨的叶片垂直于主脉剪伤，接种于包含或组成为MS+Kinetin0.08-0.12mg/L+NAA0.2-0.4mg/L+2，4-D0.4-0.6mg/L的培养基，暗室培养，每16-24天继代一次；

(2)取约疏松、生长旺盛的愈伤组织，转入液体培养基，所述培养基为步骤(1)的培养基基础上加入25-35g/L的蔗糖，在20-30℃条件下避光振荡培养，转速为100-200r/min；继代培养前，将悬浮液用150-250目钢网过滤，除去大量损伤细胞的残存碎片，再转入新鲜培养基，继续悬浮培养，继代3～4从而建立体系；

(3)从继代培养的组培苗中选取健壮、生长整齐的组培苗，剪成1.5-2.5cm左右的茎尖茎段，植入生根培养基中，所述生根培养基为包含或组成为1/2MS+AgNO₃3-5mg/L+NAA0.04-0.06mg/L的培养基；

(4)选择生长旺盛、根系发达的健壮组培苗，将瓶口的包扎物逐渐打开，使组培苗逐步适应外界环境，由开小口到完全敞开约需6-10天，在开瓶口后加入少量的水，使用玻璃罩扣住在阳光下驯化6-8天后移栽到花盆，移栽前把附着于幼苗根部的培养基冲洗干净，任选地，使用一定浓度的多菌灵溶液泡洗；移栽到花盆后仍然用玻璃罩扣养，逐步揭开玻璃罩，直到苗木在花盆中发芽生长再移入大田；灰杨组培苗移栽时，幼苗期空气相对湿度控制在80％以上，温度为18～25℃，以及适宜的光照强度。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤(1)的培养基为MS+Kinetin0.1mg/L+NAA0.3mg/L+2，4-D0.5mg/L。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的步骤(2)的培养基为1/2MS+AgNO₃4mg/L+NAA0.05mg/L。

本发明的方法达到了无性系建立、快速繁殖、工厂化育苗的目的，不仅为灰杨的工厂化繁殖和未来转基因研究提供了技术基础，且证明灰杨的非分生组织细胞也具有全能性。

具体实施方式

实施例1：

(1)选取健壮灰杨植株，将灰杨的叶片垂直于主脉剪伤，接种于多种脱分化培养基上，摸索最优良的配方(见表1)，暗室培养，每20天继代一次。

表1灰杨愈伤组织诱导所用培养基(mg/L)

灰杨在4～9号培养基上诱导的愈伤组织为浅褐色，水浸状，生长慢，再生能力差，容易死亡；1、2、3号培养基上诱导的愈伤组织为淡黄色，生长快，质地疏松，3号培养基上诱导的愈伤组织在培养25～28天后开始褐化，但是1、2号愈伤组织比3号更快褐化和停止生长，在培养18天后就开始褐化。因此MS+Kinetin0.1mg/L+NAA0.3mg/L+2，4-D0.5mg/L是灰杨的最佳培养基。

(2)取约3g疏松、生长旺盛的愈伤组织，转入约50mL液体培养基中，在约25℃条件下避光振荡培养，转速为150r/min。继代培养前，将悬浮液用200目钢网过滤，除去大量损伤细胞的残存碎片，再转入新鲜培养基，继续悬浮培养。

表2灰杨悬浮培养所用液体培养基(mg/L)

悬浮培养初期，3～4天继代一次，瓶壁上有残留物，为非胚性愈伤及细胞碎片。一周左右，悬浮物中逐渐有大量细胞散出。两周左右，散出的细胞聚集，形成小块的新鲜愈伤。但此时细胞大小不一，形状各异，随着培养时间的延长，圆形细胞逐渐增多，细胞内含物越来越丰富。有的悬浮系在悬浮过程中一直未增殖，两周之后开始褐化，不适合悬浮，弃掉。悬浮培养液逐渐变清，瓶壁上残留物减少，每两周继代一次，继代3～4，体系建立。培养物颜色淡黄、大小均一、增殖快。