[发明专利]基于DNA自组装的非酶SNP检测方法

说明书

技术领域

本发明一种核酸检测方法，特别涉及一种基于DNA自组装的非酶检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，G，C，T）替换而引起的多态性，它是一种单核苷酸的变异。

SNP具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛，易于实现自动化分析，位于基因内部编码区的SNPs可能导致蛋白功能异常，与遗传病和病变密切相关。因此，SNP研究越来越受到人们的重视，被广泛应用于生物、农业、医学、生物进化等众多领域，是目前最具发展潜力的分子标记。

在医药学研究中，如果得出某些SNP或某些SNP的特定组合与特定疾病、特定地区发病人群乃至个别患者有明显相关性，疾病的诊断和治疗将可以更有针对性，甚至做到个体化。近几年来，SNP筛查在遗传病的研究，药学的应用研究，以及肿瘤研究中都得到应用。

传统的方法用于SNP检测主要有单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism, SSCP)，能量转移标记的等位特异PCR （PCR-RFLP），分子信标 （molecular beacons），变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)，焦磷酸测序(pyro-sequencing)等。但是这些方法操作比较麻烦，费时耗力，不利于SNP的快速检测。

近几年来SNP的筛查方法取得了很大的进展，但大都以PCR方法为基础，结合电泳技术，或结合荧光、质谱、酶联免疫等方法，如寡核苷酸连接分析（oligonucleotide ligation assay，OLA），等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法（allele-specific oligonucleotide hybridization，ASO）。虽然与传统的方法相比，这些新技术操作方便，检测灵敏度高，但是它们都需要用到实验室特定的仪器，需要专业的技术人员，而且仪器价格昂贵，难以推广到所有实验室应用。因此发明一种简单、便宜、快速的方法可以准确且高通量的对SNP进行筛查具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA自组装的非酶核酸检测方法，本发明方法不应用于疾病的诊断及治疗。

本发明的另一个目的在于提供实现上述检测方法的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

基于DNA自组装的非酶检测SNP 的方法，包括如下步骤：

1)      设计分离捕获探针CP、单链MP、探针AP1和AP2，其中：

CP和MP可分别和目标序列的5’端和3’端互补为双链，在形成的双链中，CP和MP之间存在单链缺刻，该单链缺刻左侧或右侧的核苷酸与目标序列的SNP位点互补；

CP的一个末端连接有分离标记；

自组装AP1的5’端和3’端可分别和AP2的3’端和5’端互补，自组装形成双链DNA，AP1和AP2的5’端和3’端中至少部分序列可与MP的一端互补为双链；

2)      将CP、MP、核酸连接酶和样本加入反应液中，混匀，反应完全；

3)      将反应液中生成的双链DNA解链为单链DNA；

4)      将连接有分离标记的单链DNA分离，清洗去除其他游离DNA链；

5)      将清洗后的带分离标记的单链DNA、AP1、AP2加入反应液，反应完全以形成自组装双链；

6)      将连接有分离标记的DNA链分离，清洗去除其他游离DNA链；

7)      通过检测清洗后的DNA链中双链DNA的量，确定SNP的量。

CP和MP的长度独立为15～30bp。

AP1和和AP2的长度独立为20～50 bp。

该方法中，分离标记为亲合基团、固相载体。

该方法中，核酸连接酶选自 T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、Tsc DNA连接酶。

优选的，将清洗后的DNA链与特异性嵌入双链DNA中的荧光染料反应，之后检测其荧光值确定双链DNA的量。

优选的，通过加热之后急冷将双链DNA解链为单链DNA。

实现上述检测方法的试剂盒，该试剂盒中含有CP、MP、AP1和AP2。

本发明的有益效果是：

（1）本发明体系中无需加入聚合酶进行信号扩增，减少了背景信号。