[发明专利]检测沙粒病毒科病毒的简并引物及RT-PCR检测方法有效
| 申请号： | 201310146457.9 | 申请日： | 2013-04-25 |
| 公开（公告）号： | CN103224999A | 公开（公告）日： | 2013-07-31 |
| 发明（设计）人： | 胡群;马思杰;邹春颖;童淑梅 | 申请（专利权）人： | 中华人民共和国大榭出入境检验检疫局 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 宁波奥圣专利代理事务所(普通合伙) 33226 | 代理人： | 程晓明 |
| 地址： | 315812 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 沙粒 病毒科 病毒 引物 rt pcr 方法 | ||
1.检测沙粒病毒科病毒的简并引物，其特征在于该简并引物的核苷酸序列如下：上游引物：CATGTATGAT TGATGGAGGA AATatgytng arwc，下游引物：GATCATTTGG TGGTCCTTCA atrtcnancc a，其中引物中r可以是g或a，y可以是c或t/u，w可以是a或t， n可以是g或a或c或t/u或其它。
2.利用权利要求1所述的简并引物检测沙粒病毒科病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于步骤如下：
a、RNA提取：用RNA提取试剂盒提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；
b、RNA逆转录：用RNA逆转录试剂盒对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行；
c、PCR反应： 25μLPCR反应体系为10×PCR 缓冲液 2.5μL、浓度为25mM的MgCl2溶液1.5μL、浓度为10mM的dNTP液0.5μL、浓度为5U/μL的Taq酶液 0.5μL、浓度为25μM的上游引物溶液1μL、浓度为25μM的下游引物溶液1μL，上述PCR模板2μL，余量为灭菌去离子水；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃ 延伸1min，45个循环，72℃延伸7min，4℃保存PCR产物，上游引物溶液含有核苷酸序列为CATGTATGATTGATGGAGGAAATatgytngarwc的引物，下游引物溶液含有核苷酸序列为GATCATTTGGTGGTCCTTCAatrtcnancca的引物；
d、琼脂糖凝胶电泳：将上述PCR产物用重量百分浓度1～1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳电压100v，电泳时间30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现408～429bp大小片段的条带，则为沙粒病毒科病毒。
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