[发明专利]检测沙粒病毒科病毒的简并引物及RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

 本发明涉及沙粒病毒的检测，具体涉及检测沙粒病毒科病毒的简并引物及RT-PCR检测方法。

背景技术

沙粒病毒科（Arenaviridae）属于单股负链RNA。沙粒病毒科仅有一个属即沙粒病毒属（Arenavirus genus），已知共有20余种病毒，根据沙粒病毒抗原物质和地理分布不同，将沙粒病毒分为旧世界沙粒病毒（Old World Arenaviruses）和新世界沙粒病毒（New World Arenaviruses）两大类，旧世界沙粒病毒在全球均有分布，包括拉沙热病毒（Lassa Virus,LASV），莫佩亚病毒（Mopeia Virus,MOPV），伊派病毒（Ippy Virus,IPPYV），莫巴拉病毒（Mobala Virus,MOBV），淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）；新世界沙粒病毒根据基因序列分为A、B、C三个种系。A种系包括病毒：皮里陶病毒（Pirital virus，PIRV），弗莱克病毒(Flexal virus ,FLEV), 帕腊南病毒(Parana virus,PARV)，奥尔帕瓦约病毒（Allpaahuayo virus，ALLV），皮钦德病毒(Pichinde virus，PARV)，熊峡谷病毒（Bear Canyon virus，BCNV），白水河病毒（Whitewater Arroyo virus，WWAV），太米阿米病毒（Tamiami virus，TAMV）；B种系包括：沙比亚病毒(Sabia virus，SABV)，马秋博病毒（Machupo Virus，MACV）， 拉胡宁病毒( Junin virus,JUNV)， 塔卡里伯病毒病（Tacaribe virus，TCRV），库皮科斯病毒（Cupixi virus，CPXV），瓜納瑞托病毒（Guanarito virus，GTOV），阿马帕里病毒（Amapari virus，AMAV），C种系包括：拉蒂诺病毒（Latino virus, LATV），奥利华斯病毒（Oliveros virus，OLVV）等。沙拉病毒引起的人类疾病有淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、拉沙热、阿根廷出血热、和玻利维亚出血热等，其中鼠类携带和感染淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，主要分布在欧美和亚洲，国内曾有少数病例。拉沙热病毒主要发生在西非，能引起发热、头疼、肌痛等症状，严重有出血和休克，病死率为15~25%。胡宁病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒能引起人类出血性疾病，而且感染性极高。目前基因检测方法中或者使用特异性型引物只针对沙粒病毒科内某个病毒，如公布与为CN102719557的发明专利申请，就公开了包括检测拉沙热病毒在内的多重PCR试剂，但对于沙粒病毒科全病毒通用型检测引物还未见公开报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供检测沙粒病毒科病毒的简并引物，该简并引物可以检测出沙粒病毒科的病毒，是沙粒病毒的通用引物。本发明还提供了利用简并引物检测沙粒病毒科病毒的RT-PCR方法。

检测沙粒病毒科病毒的简并引物，该简并引物的核苷酸序列如下：上游引物：CATGTATGAT TGATGGAGGA AATatgytng arwc，下游引物：GATCATTTGG TGGTCCTTCA atrtcnancc a，其中引物中r可以是g或a，y可以是c或t/u，w可以是a或t， n可以是g或a或c或t/u或其它。

利用检测沙粒病毒科病毒的简并引物的RT-PCR检测方法，其步骤如下：

 a、RNA提取：用RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行； 

b、RNA逆转录：用RNA逆转录试剂盒（购于Promega公司）对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行：在0.2mL eppendorf管中加入oligo d(T)₁₅ primers（50μM） 1μL，上述RNA 约10μL，72℃ 10.min ，加入5×RT 缓冲液 4μL、dNTP液（10mM each）1μL、AMV反转录酶液（10U/μL）1μL、RNA酶抑制剂(20U/μL) 0.5μL、无RNA酶水 1.5μL，42℃ 1h，72℃ 10min；反应产物即为后续的PCR模板；