[发明专利]用于沙门氏菌实时定量PCR检测的特异性引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种沙门氏菌的实时定量PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

食源性病原微生物是食品安全检测的重要项目，而沙门氏菌是常见的食品病原微生物，该类病原物感染易造成高烧、上吐下泻，严重时引起败血症等并发症，特别是五岁以下的儿童出现该等并发症的风险较高。沙门氏菌检测是重要的检测项目，目前我国检测的手段主要依靠传统检测方法，检测周期长，操作复杂。传统的分离培养法工作量大，且需要超净台培养箱等大仪器，检测周期要8-10天。酶联免疫检测法的要1-2个工组日，且易受抗体性能和样品中杂质的干扰，易出现假阳性假阴性的结果。

本方法通过Taqman探针法快速特异检测病原微生物，较传统方法检测周期短，灵敏度高，特异性强。可实现食品病原微生物的快速准确检测，为食品安全保驾护航。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一组检测沙门氏菌的实时定量PCR特异性引物及探针。

本发明所述的一种用于沙门氏菌实时定量PCR检测的特异性引物和探针，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的序列如SEQ ID NO:3所示，探针的5’端有FAM荧光报告基团，3’端有BHQ荧光淬灭基团。

上游引物：5’-ATACCAACCGGCAAGGCATA-3’（SEQ ID NO:1）。

下游引物：5’-GCGCCTGCCGTTATCACT-3’（SEQ ID NO:2）。

探针：5’FAM-AACTCAAGGCGATCAAATATCTGCGGC-BHQ3’（SEQ ID NO:3）。

本发明的第二个目的在于提供一种沙门氏菌的实时定量PCR检测试剂盒。

本发明所述的用于沙门氏菌实时定量PCR检测的试剂盒，含有如权利要求1所述的特异性引物和探针、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、Taq酶、阳性对照和阴性对照。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述阳性对照为沙门氏菌ATCC14028标准株。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述阴性对照为ddH₂O。

本发明的第三个目的在于提供一种沙门氏菌的实时定量PCR检测方法。

本发明所述的沙门氏菌的实时定量PCR检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样品DNA；

（2）以待测样品DNA为模板，利用如权利要求1所述的特异性引物和荧光探针进行实时荧光PCR扩增；

（3）根据待检样品的Ct值，对照预先建立的沙门氏菌标准株的标准曲线，计算样品中沙门氏菌的浓度。

根据本发明所述的检测方法的进一步特征，所述实时荧光PCR扩增的体系组成如下：

组分                 终浓度

PCR缓冲液            1×

dNTPs                 0.2mM 

MgCl₂                          4.0mM

Taq酶                 1U

特异性引物            0.3uM

TaqMan探针           0.2uM

溶剂为ddH₂O ，

实时荧光PCR条件为：95℃预变性5min，然后94℃ 15s、60℃ 45s、72℃ 10s共45个循环。 

本发明建立了利用TaqMan实时定量PCR技术检测沙门氏菌丰度的方法，经模拟实际样本检测，表明该方法切实可行，灵敏度高。此外，由于本方法采用闭管操作，不需要电泳及凝胶成像等操作，使该检测方法操作减少污染概率也大为降低，检测周期缩短。

附图说明

图1为实时定量PCR灵敏性检测结果（从左至右依次为：8×10⁸、8×10⁷、8×10⁶、8×10⁵、8×10⁴、8×10³、8×10²、8×10 CFU/mL）；

图2为实时荧光定量PCR标准曲线（X坐标为菌浓度的对数，Y坐标为Ct值，公式为y = -4.3057x + 45.083，算出X值后，有指数函数和稀释倍数推算出样品实际浓度；