[发明专利]一种玉米抗病相关基因MR4及其在玉米抗病改良中的应用

说明书

技术领域：

本发明属于植物分子生物学与植物基因工程技术领域，具体涉及一种玉米抗病相关基因MR4的克隆、植物表达载体的构建及其在玉米抗病改良中的应用。

背景技术：

病害是制约粮食增产稳产的重要原因，据估计每年有30％的粮食减产是由病害造成的，因此控制病害是保证粮食增产和稳产的重要途径。传统的病害防治策略主要是通过杂交育种培育抗病品种，或者辅助施用化学农药及化学诱导剂的方法加以防治。植物的基因工程在近30多年的发展时间里显示出巨大的潜力，而利用基因工程开展抗病分子育种正呈现出广阔的前景。

植物在长期遗传和变异过程中，形成了一套具有控制或抵御病原菌侵染的复杂的防卫系统，防卫系统的启动和功能性运转依赖抗病或抗病相关基因，以及防卫基因的高效表达。抗病及抗病相关基因的克隆对于培育抗病作物品种和研究病原物与寄主作用机制具有十分重要的意义。

Npr1是拟南芥等多种植物参与防卫反应的转录因子，超量表达Npr1可以提高拟南芥等多种植物的抗病性(Cao et al.1998)；Pto(Tang et al.1999)、Cf-9(Hammond et al.1998)、Xa21（Wang et al.,1996）、N(Witham et al.1996)等抗病基因也相继被克隆和用于作物抗病基因工程中，但源于玉米的抗病基因研究进展缓慢，抗病基因工程相对薄弱。

玉米是我国最主要粮食作物之一，在国民经济生产中占有举足轻重的地位。随着玉米产业的发展，玉米种植面积在不断扩大，而一些新老病害也交替或连年发生，从而影响了玉米的产量和品质，其中以玉米大/小斑病、圆斑病和弯孢霉病等长孺孢菌引起的叶部病害尤为突出。分离玉米抗病或抗性相关基因，用于玉米基因工程进行辅助育种和抗性改良对有效控制玉米病害、提高玉米产量和改善玉米品质具有极其重要的意义。

发明内容:

本发明要解决的一个技术问题是提供一种玉米抗病基因MR4，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

可以采用PCR技术，从已接种玉米大斑病菌的玉米的基因组、总mRNA或其反转录产物cDNA中扩增获得玉米抗病基因MR4或其部分核苷酸序列，也可以采用已经克隆的MR4基因或其部分有效片段作探针，从cDNA或基因组文库中筛选到玉米抗病基因MR4。该基因的开放阅读框（ORF）核苷酸长度为2727bp，编码一种由908个氨基酸组成的抗病类似蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该基因编码的蛋白质包含LRR，NB-ARC和AAA-ATPase等抗病基因所特有的功能域。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种玉米抗病基因MR4表达载体。

所述玉米抗病基因MR4表达载体通过下述方法构建：将通用双元载体pTF102的多克隆位点切除，再将其GUS基因上游的2×35S启动子换成玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子，获得遗传转化载体pTE102-M；将玉米抗病基因MR4用限制性内切酶BamHI和KpnI消化后回收包含MR4完整阅读框的DNA片段；将回收的DNA片段插入到遗传转化载体pTE102-M的限制性内切酶酶切位点。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种上述玉米抗病基因MR4在玉米抗病改良中的应用。

利用分离得到的MR4基因或其有效部分连接到超量表达载体中，通过转化病害敏感玉米，可以获得超量表达MR4基因的抗病转基因玉米，该转基因玉米具有较强抗真菌性病害的能力。

本发明要解决的第四个技术问题是提供一种通过超量表达MR4基因培育抗病玉米的方法。

附图说明:

序列表SEQ IDNO：1.本发明的玉米抗病基因MR4的核苷酸序列。

序列表SEQ IDNO：2.本发明的玉米抗病基因MR4编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1.本发明的玉米抗病基因MR4编码的蛋白质及其功能域分布。

图2.遗传转化载体pTF102-M的结构示意图。

图3.转基因玉米植株与非转基因玉米植株玉米抗病基因MR4表达量检测结果示意图。

具体实施方式:

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：玉米抗病基因MR4的克隆