[发明专利]一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法。

背景技术

由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，利用可再生资源制造生物能源已受到世界各国的普遍重视。丁醇由于其优良的燃烧特性及较乙醇更优的储存运输特性，有望在将来成为新一代生物燃料。自二战以来随着石油工业的发展，生物丁醇发酵由于其较高的原料成本，其大规模发酵一直处于停滞状态，而且随着近年来粮食价格的不断上涨及国家相关粮食安全战略的制定，采用粮食发酵生产燃料丁醇已受到严格限制。

拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）是能够发酵产生丁醇的四种梭菌之一[1]，在发酵过程中产生丁醇、丙酮、乙醇以及少量的乙酸和丁酸[2]。拜氏梭菌除了能利用葡萄糖外，还能利用木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖醇等多种碳源[3]。由于葡萄糖和木糖分别是纤维素和半纤维素水解后的主要成分，因而拜氏梭菌可以利用纤维素和半纤维素水解液为原料进行生物丁醇发酵。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。和其它很多细菌不一样的是，拜氏梭菌在葡萄糖存在条件下，仍能顺利代谢木糖等五碳糖，说明该菌不存在碳代谢物阻遏效应（carbon catabolite repression，CCR）。但是无论是葡萄糖还是木糖发酵，该菌均存在糖消耗率低的问题[4]，在木糖发酵中这一现象尤为明显。因此，提高木糖消耗率成为木质纤维素原料应用于拜氏梭菌丙酮丁醇发酵的关键技术之一。

拜氏梭菌属于革兰氏阳性菌，GC含量30%，2007年完成全基因组测序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000721），其中含有预测可能的木糖转录调控蛋白的xylR基因，该基因在NCBI核酸数据库查询号为gi:149903712。在革兰氏阳性菌中，XylR对木糖代谢基因进行转录负调控[5,6]。有报道在低浓度木糖存在下，敲除xylR能增强突变株中木糖代谢相关基因的酶活[7]，但是当木糖浓度较高时，xylR缺失株的木糖代谢相关基因的酶活和野生型处于相当水平，xylR的转录负调控可被彻底解除[8,9]。例如，在另一种产溶剂梭菌—丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC824中，敲除xylR(CAC3673)并未提高该菌在较高木糖浓度下的木糖的消耗率，说明XylR在该菌的木糖代谢途径改造中不具备研究价值。微生物中经由木糖异构酶催化的木糖代谢主要包括：1）木糖通过转运蛋白从胞外向胞内运输；2）胞内木糖通过两步（木糖异构酶和木酮糖激酶）催化反应生成5-磷酸-木酮糖；3）5-磷酸-木酮糖进入磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）进行代谢，最后的代谢流则进入糖酵解途径。在拜氏梭菌中，尚没有木糖或阿拉伯糖代谢途径以及调控基因的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法，从而能高效利用水解液中的葡萄糖-木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇。

本发明通过抑制拜氏梭菌xylR基因表达，抑制araR基因表达和/或增强木糖转运蛋白的活力实现。

根据本发明的一个优选实施例，通过在拜氏梭菌xylR基因中插入外源DNA片段以使xylR基因表达被抑制，在拜氏梭菌araR基因中插入外源DNA片段以使araR基因表达被抑制，和/或过表达xylT基因（例如导入pIMP1-ptb-xylT）可实现本发明。

本发明还有一个目的在于，提供其xylR基因表达被抑制，araR基因表达被抑制和/或其xylT基因过表达的拜氏梭菌（C.beijerinckii）重组菌株。

根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的拜式梭菌重组菌株的基因组中xylR基因中已插入外源DNA片段，araR基因中已插入外源DNA片段和/或过表达xylT基因。

本发明还有一个目的在于，提供该重组菌株用于高效利用葡萄糖-木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种提高拜氏梭菌利用葡萄糖-木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇能力的方法，该方法通过抑制拜氏梭菌xylR基因表达，抑制araR基因表达和/或过表达xylT基因实现。