[发明专利]一种高效水解大豆异黄酮糖苷的β-葡萄糖苷酶基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶新基因，尤其涉及一种高效水解大豆异黄酮糖苷的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶和重组酶的应用，属于基因工程领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)属于糖苷水解酶家族，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(β-D-glucoside glucohydrolase；EC3.2.1.21)，一方面，该酶可以催化水解β-糖苷键，释放出葡萄糖和相应的糖苷配基。另一方面，该酶还能催化转糖苷缩合反应，合成低聚糖。研究发现，游离型的大豆异黄酮糖苷才能发挥其生物活性，β-葡萄糖苷酶在催化水解结合型糖苷产生游离型糖苷方面具有重要作用，显著提高异黄酮糖苷的水解效率，从而为工业上大批量生产高活性大豆异黄酮苷元产品提供捷径。在纤维素降解过程中，β-葡萄糖苷酶可以与其他几种纤维素降解酶协同作用，将纤维素降解为葡萄糖，后者经微生物发酵作用即可产生燃料乙醇等能源物质。在食品行业中，该酶能够利用β-葡萄糖苷酶水解风味前体物质β-糖苷以释放出风味活性物质糖苷配基，从而增强葡萄酒、果汁和茶叶等产品的香气。另外，在医药领域中，可通过检测人体血清中β-葡萄糖苷酶活性的高低来判断是否患有乳腺癌。因此，β-葡萄糖苷酶在生产有活性大豆异黄酮苷元、能源、食品及医药等领域具有重要应用价值。

大豆异黄酮主要有12种化学成分，大豆苷元、染料木素和黄豆黄素3种游离型异黄酮苷元以及它们和丙二酰基葡糖糖、乙酰基葡萄糖、葡萄糖以β-葡萄糖苷键的方式结合成的9种异黄酮糖苷组成。大豆异黄酮具有抗肿瘤、扩张血管和抗氧化等作用，同时还可预防骨质疏松症和妇女更年期综合症等疾病，因此，受到越来越多国内外消费者的青睐。研究表明，大豆苷元、染料木素和黄豆黄素3种游离型异黄酮苷元是大豆异黄酮发挥生物活性功能的主体，而占大豆异黄酮总量80％～99％的9种结合型糖苷则无生物活性。这些异黄酮糖苷只有被水解为游离型的苷元后才能被小肠壁吸收，发挥其生物活性作用，但大豆自身含有的内源性β-葡萄糖苷酶的酶活性很低，只能水解22％～29％的异黄酮糖苷，因此，在豆制品中添加高活性的β-葡萄糖苷酶以提高异黄酮糖苷水解效率在食品工业中具有重要意义。

目前，已经从不同微生物中分离出来多种β-葡萄糖苷酶，主要包括里氏木霉(Trichoderma Reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、斜卧青霉(Penincillium decumbens)、土曲霉(Aspergillus terreu)、多粘性芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、链霉菌(Streptomyces)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等。鉴于传统的微生物分离培养技术分离出的β-葡萄糖苷酶在酶的活性、稳定性、底物特异性等方面存在各式各样的差异，以及环境中99％的微生物是不可培养的，所以，为了适应不断发展的、不同领域的工业应用，迫切需要从自然界中挖掘和鉴定具有新特性的β-葡萄糖苷酶。

宏基因组学(Metagenomics)是一种不依赖于微生物的分离培养，直接以特定生态环境中微生物群体基因组总和作为研究对象，同时利用序列分析和功能筛选作为研究手段，构建宏基因组文库从而筛选出新的基因及生理活性物质。宏基因组技术作为一种新兴学科领域，在很大程度上促进了环境微生物资源的利用，特别是未培养微生物资源的开发利用。因此该方法为发现更多的新型β-葡萄糖苷酶提供了有效途径。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中获得具有高效水解大豆异黄酮糖苷性质的新型β-葡萄糖苷酶的研究报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种β-葡萄糖苷酶的新基因。

本发明的第二个目的在于提供上述β-葡萄糖苷酶的宏基因组学克隆方法。

本发明的第三个目的在于提供上述新型β-葡萄糖苷酶的DNA表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种由上述表达载体转化细胞而获得的基因工程菌。

本发明的第五个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组β-葡萄糖苷酶及其制备方法。

本发明的最后一个目的在于提供利用上述重组β-葡萄糖苷酶在高效水解大豆异黄酮糖苷中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种新型β-葡萄糖苷酶的DNA，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的上述新型β-葡萄糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。