[发明专利]一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法

权利要求书

1.一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴等电聚焦：收集发酵过程中菌丝体，PBS缓冲液洗涤3次，加入液氮研磨至粉末状，加入适量裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/ml RNase，混匀，冰浴15分钟，冰浴超声2分钟，14000 rpm，4度离心30分钟取上清，从冰箱中取出美国Bio-Rad公司的pH 4-7的IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时；将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，并用上样缓冲液稀释至170μl，对好正、负极，盖上盖子，MultiphorII电泳系统进行等电聚焦；

⑵平衡：聚焦结束的胶条先将胶条放入平衡缓冲液I水平振荡15分钟，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15分钟；

⑶第二向SDS-PAGE电泳：第二次平衡结束后，将胶条从样品盘中移出，放到已配好的12%的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5%的琼脂糖将胶条和marker封严，不能产生气泡，并将胶板固定于电泳槽内，加入电泳缓冲液，接通电源，15mA/胶恒流电泳15分钟，然后250v恒压电泳，待溴酚蓝达到底部边缘时即可停止电泳，电泳结束后，撬开两层玻璃，取出凝胶，将凝胶放入装有染色液的水平盘内振荡过夜进行染色，染色后，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡脱色；

⑷蛋白点的胶内酶解：①凝胶平铺于染色盘上，切下用于质谱检测的蛋白点，用50 μL去离子水将其吹入96孔PCR板的小孔中，吸出去离子水后加入50 μL脱色液；

②在50℃条件下振荡15 分钟，将脱色液吸出，重复一次，直至胶块完全呈无色状；

③加50 μL去离子水，50℃振荡15 分钟，洗去残留的脱色液和胶块中的离子；

④加30 μL乙腈，静置5-10 分钟，胶块变为白色后吸出乙腈，室温静置20 分钟，使乙腈挥发； 

⑤在胶块上面加6-12 μL的酶解液，使酶解液没过胶块，封好PCR板，37℃振荡过夜酶解；

⑸MALDI-TOF 4700 Proteome Analyser质谱仪鉴定蛋白

①把质谱样品板洗干净抛光，然后用异丙醇去极性后晾干，备用；

②在质谱样品板四周边缘六个孔上都点上ABI公司校准液，在中间点样孔处点上0.3 μL酶解液后再点上0.3 μL质谱自带基质溶液自然混合，晾干；

③冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪测定；

④美国ABI公司的GPS 3.5软件对质谱数据进行分析，米曲霉蛋白质数据库检索。

2.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述裂解液成分为：8M尿素，2M硫脲，0.5% g/%ml，CHAPS，2% g/%ml美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，1wt%DTT，1mM PMSF。

3.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述溶胀缓冲液的成分为wt%：8M尿素，2M硫脲，0.5% CHAPS，0.52%美国Bio-Rad公司pH4-7两性电解质，0.02%溴酚蓝，1%DTT。

4.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述的等点聚焦程序为：

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5.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述的上样缓冲液成分为wt%：8 mL 0.5 M Tris pH 6.8，6.4 mL甘油，12.8 mL 10% SDS，3.2 mL巯基乙醇，1.6 mL 0.05%溴酚蓝，超纯水32 mL。

6.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液I成分为wt%：50mM Tris-HCl pH6.8，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2%DTT，0.02%溴酚蓝；

所述平衡缓冲液II成分为wt%：50mM Tris-HCl pH6.8 ，6M尿素，30%甘油，2% SDS，2.5%IAA，0.02%溴酚蓝。

7.根据权利要求1所述的分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：所述染色液成分为wt%：10%硫酸铵，10%磷酸，0.12%G250，20%甲醇；所述脱色液配置方法为：3%冰醋酸溶液。